分离细胞的方法.docx

分离细胞的方法单细胞的分离是单细胞序列测定中最难的一步，其方法复杂、操作繁琐、成本高，制约了单细胞序列的进一步发展。近年来，由于单细胞分离技术的不断创新，使细胞损耗和操作费用明显减少，单个细胞的捕捉速率和准确度得到明显改善。目前，单细胞分离方法主要有口吸管技术、极限稀释技术、激光捕获显微切割技术、荧光流式细胞分选技术、微流控技术等。其中，极限稀释法、显微操作方法等是一种低通量、高劳动强度的单细胞分离方法，而流式分选技术则能实现稳定、自动化地获得单一细胞，极大地促进了高通量单细胞测序技术的发展。近年来，随着微流控技术的发展，使得以低廉的价格，可以在同一时间内，对成千上万的个体细胞进行测序，并逐步推进了单细胞测序的三代测序法。下一步，我们将着重于把个别细胞分离出来用于后续的分析和培养。1 .吸式技术通过显微镜观察，可以选用形态良好的细胞，再用吸管技术将单个的细胞吸出，由于可视化操作，可以获得完整的形态和几乎没有损伤的细胞。但是这种工艺需要熟练的操作者，而且受人工干扰，流量小。2 .极限稀释法很多实验室和企业都采用手工吸液器，将细胞悬液稀释，从而将个体细胞从体内分离出来。由于细胞在悬浮液中的分布及浓度，将其分为许多小块，在高稀释样本中，每个样本中的细胞数目会很少，直到每一份样本只有一个细胞。这种方法不需要特别的设备，具有操作简便、费用低廉的特点。但它易失活，效率低下。3 .激光捕获显微切割技术激光捕捉显微切割技术是一项能够将大多数实体组织标本中的单细胞或胞间室分离出来的新技术。用显微镜对组织进行观察，并用肉眼辨认出靶细胞。操作者在显示器上划出一条线，把要切割的那一段划出来。沿着这个路径，用激光切割，取出组织。有些1CM系统还可以对活体组织进行解剖，这样就可以将活的细胞取出用于培养和分析。1CM与免疫组化法相结合，为固体样品在单细胞层面上的分析提供了强有力的工具。近年来，利用1CM技术对单细胞进行单细胞分析，包括单细胞RT-PCR、法医学中的短链重复分析、蛋白质印迹技术、质谱技术等。但这种方法要求有一个小型的激光切割平台，而且操作比较复杂。4 .荧光流式分选法经过荧光染色或标记的单细胞悬浮液，在压力作用下被压进流动室，在鞘液的推动下，以一种特定的速率从流动腔中喷射出来。利用相应的荧光探测和瞬间充电技术，得到了目标细胞，并进行了单细胞的分离。FACS技术在DNA含量分析，免疫表型分析，可溶性分子定量，细胞周期分析，造血干细胞，凋亡，亚群数量，微生物分析，肿瘤诊断。样本的种类几乎覆盖了血液，骨髓，肿瘤，植物，原生质体，酵母，细菌，甚至是病毒。流式分选技术虽然能够实现单细胞的高通量分离，但要求有分离能力的流式细胞仪、稳定的荧光标记物和荧光染色剂，而且必须配制一定数量的细胞悬浮物，不适合于微量样品。5 .微流控技术微流控技术是利用流体力学的基本原理，将水和油从不同的微管道中分离出来，并与之混合，从而形成一种“油包水”，将单个细胞、反应试剂等用微滴产生设备包裹在一小滴中，从而形成一种微反应系统。近年来，人们开发了许多微流控芯片，并为单细胞的分析和处理提供了实验设备。目前最受欢迎的IoXGenOmiCSehroIniUn1平台，采用微流体技术，可以在10分钟之内，自动捕捉多达80,000个细胞。它将单个细胞包裹在一小滴油中，逆转录cDNA,再由油滴破裂，释放出cDNA,形成一个整体的文库，增加了实验流量，适合大规模单细胞的研究。但是，需要特殊的试验仪器，细胞数量多，细胞大小均匀，耗材昂贵。