酵母蔗糖酶米氏常数的测定.docx

酵母蔗糖酶米氏常数的测定原理当环境的温度、PH和酶浓度等条件恒定时，酶促反应的初速度V随底物的浓度S增高而加快，直至达到一极限，即最大反应速度Vmaxo根据底物浓度和反应速度的这种关系，Michae1is-Menten推导得出如下公式：-VmaxSV=Km+S式中Kin为米氏常数。它是酶的特征性常数。测定Kn1是研究酶的一项重要工作。大多数酶Km在IOTIOfnIO1/1左右。但是Michae1is-Menten方程中反应速度V与底物浓度S之间为双曲线关系，通过作图求Km值极不方便。1ineWeaVe1BUrk根据米氏方程又推导出如下直线方程：1Km11=-+VVmaxSVmax以1S为横坐标，1/V为纵坐标，将各点连成一直线，此线向左延长与横轴相交处即为米氏常数（Km）的负值。本实验是用比色法测定一定时间内、一定量的蔗糖酶作用于不同浓度的底物（蔗糖）生成产物的量，即葡萄糖的量。此产物的生成量为反应速度，然后按1ineweaVe1BUrk双倒数作图法作图（图14）,就可以求出Kn1值。图141ineWeaVe1BUrk双倒数作图法试剂1. 0.03mo11蔗糖溶液。2. 0.2mo11pH5.0醋酸缓冲液：取0.2mo11醋酸钠溶液70m1与0.2mo11乙酸溶液30m1相混合。3.蔗糖酶溶液：干酵母2.5g置研钵中，加蒸储水4m1,用力研磨10分钟，转移到离心管中，用25m1蒸储水洗研钵，并将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置50分钟，离心(2000rmin5min),小心取出上清夜备用。置冰箱保存。实验时根据需要用蒸储水适当稀释。(约25倍稀释)4 .碱性硫酸铜溶液：取无水Na£(MOg溶于40On11蒸储水中；酒石酸7.5g溶于35Ond蒸储水中；结晶硫酸铜(CUSo45氏0)4.5g溶于20On1I蒸储水中，以上分别加热促溶。冷却后将酒石酸溶液倾入Na2CO:,溶液中，混匀。再将硫酸铜溶液倾入，并加蒸饱水至总量为IOOOm1o此试剂可在室温中长期保存。如放置数周后生成沉淀，可用优质滤纸过滤后使用。5 .磷铝酸试剂：烧杯内加入铝酸70g,鸨酸钠10g,10%Na0H溶液400m1及蒸储水400m1o煮沸2040分钟以除去铝酸内可能存在的氨。冷却移入IOOOrn1容量瓶内，加浓磷酸(85%)250m1,混匀。最后以蒸播水稀释至IOOon11。6 .葡萄糖标准溶液(0.05mgm1):(1)葡萄糖标准贮存溶液：(1Omg/m1)：以分析天平称取1OOog纯葡萄糖，置于小烧杯中加0.25%苯甲酸溶液使溶解，倾入IOOnI1容量瓶中以0.25%苯甲酸溶液稀释至刻度。(2)葡萄糖标准应用液(0.05mgm1):用吸管吸取上述葡萄糖标准贮存液5.Ond放入IOOOrn1容量瓶内，用0.25%苯甲酸溶液稀释致刻度。主要器材1 .恒温水浴及沸水浴2 .721分光光度计主要操作步骤1.将蔗糖酶溶液置30C水浴预温5分钟。2,取试管5支，编号，按表14操作。表14试剂(m1)管号123450.03mo11蔗糖溶液5.02.51.51.00蒸镭水02.53.54.05.0pH5.0醋酸缓冲液0.50.50.50.50.5充分混匀，30C水浴预温5分钟蔗糖酶溶液0.50.50.50.50.5立即混匀，30C水浴准确保温10分钟碱性硫酸铜溶液1.01.01.01.01.0混匀，中止酶反应。另取试管6支，编号。向15管加入上面相对应的5管反应液各0.5m1,再各加蒸镭水15m1；第6管加入葡萄糖标准液2nd。然后按表15操作：表15管号试剂(m1)123456碱性硫酸铜溶液2.02.02.02.02.02.0混匀，置沸水浴8分钟，取出冷却磷铝酸试剂2.02.02.02.02.02.0混匀，静置3分钟蒸储水2.02.02.02.02.02.0将各管混匀，选用42Onn1波长比色，以笫5管作为空白管调零，第6管作为标准管，记录各管光密度。结果与计算14号管酶促反应所产生的还原糖的mo1数按下式计算：还原糖(mo1)测定管光密度7.01000标准管光密度x0*NX-180按照1ineweaver-Burk作图法，以1S为横坐标，10分钟内酶促反应产生的还原糖mo1的倒数1/v为纵坐标作图。将各点连成直线并延长此线与横轴相交点即为酵母蔗糖酶的Kn1值的负值。本实验条件下测得的酵母蔗糖酶Kni值约为4.2×1011o