植物和动物组织样本的处理方法、动物和植物组织切片厚度、FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法.docx

附录A（资料性）植物和动物组织样本的处理方法A.1植物组织样本的处理方法A.1.1植物组织样本固定处理植物组织样本固定处理步骤如下：a）操作人员提前准备好大小合适的容器，配制2次使用量的卡诺氏固定液（乙醇：冰醋酸=3:1）,置于冰上或在-20的温度下预冷；注：固定液体积不应超过容器容积的四分之三。b）配制2次使用量的蔗糖-PBS缓冲液（3%）,配制方法见附录C. 2；c）使用酒精对工具进行消毒并擦干，剪取植物材料,迅速放入预冷的卡诺氏固定液中,置于冰上或-20温度下固定1小时；d）去净固定液，加入新鲜的预冷过的卡诺氏固定液中，置于冰上或-20温度下固定1小时；e）滤去固定液，加入预冷的蔗糖-PBS溶液（3%）,冰上放置1小时；f）滤去溶液后，重新加入新的预冷蔗糖-PBS溶液（3%）,在4的温度下放置过夜;g）准备包埋盒并进行信息标记，加入OCT后置于冰上预冷；h）滤去液体后，同镣子轻夹出样本，吸干表面液体后将样本剪切成合适包埋的尺寸,放入包埋盒中；注：固定后的植物样本非常绵软，在夹出及修剪尺寸时要注意力度。i）调整样本方向，将样本横切面垂直于包埋盒一侧的侧壁，使横切面贴在侧壁上方便后续切片；j）将装有样本的包埋盒水平放置于小冰盒中，并将其水平放置于真空抽滤的干燥器,真空抽滤5分钟（-0. IMpa）；k）将包埋盒水平放置于有盖容器中，盖上盖子于4c的温度下放置过夜后即可进行包埋，包埋操作程序见5. 2。A.1.2植物组织样本直接包埋前处理植物组织样本包埋前处理步骤如下：a）使用酒精对工具进行消毒并擦干；b）取植物样本，用剪刀剪下测试部位，并将样本剪切至便于包埋的尺寸；注：以叶片为例，可将一片叶子沿垂直于主叶脉方向剪成宽度约0.5 cm的小条，尽量控制叶片宽度短于包埋盒长度，若叶片过大可按需要修剪。c）用镣子夹起剪切好的植物样本，快速放入在冰上预冷的OCT包埋盒中，并调整样本方向；注：以叶片为例，将叶片条竖起，横切面正对包埋盒的底面，将叶片条沿着包埋盒的一遍竖直排列在OCT中，用镶子将叶片条轻轻往下压，使叶片横切面尽量贴到包埋盒底部，尽量保持叶片条垂直于包埋盒底部，不倾斜；以花序为例，用镣子将花序轻轻下压，使花序以侧面方向贴到包埋盒底面，并用镜子轻压每朵消化，使其尽量贴到包埋盒底面。d）将装有植物样本的包埋盒水平放置到冰盒中，再将冰盒水平放置于真空抽滤的干燥器中真空抽滤5分钟（-0. IMpa）；0）抽滤后，材料位置会发生一定变化，再次用镜子轻压样本，使样本贴在包埋盒底面上，以方便后续切片；f）参照5. 2进行包埋处理。A.2动物组织样本的处理方法A. 2.1动物组织样本处理（灌流取样法）动物组织样本处理步骤如下：a）根据动物类型选择合适的麻醉剂，对实验动物进行深度麻醉，应确保对实验动物的四肢或肌肉进行动作时，无任何疼痛或应激反应；b）将动物头部固定在立体定位仪上，沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏。与心尖成30°45°夹角剪开左心室，随即剪开右心耳，将灌注针头从左心室插入主动脉，固定针头；c）灌注常温通氧的人工脑脊液（ACSF, 0.6L/kg）,并记录开始灌注时间；d）常温ACSF灌注结束后，开始灌注提前预冷通氧的ACSF,记录开始灌注时间；e）预冷ACSF灌注10分钟后，观察灌注效果，准备取样本组织；f）样本组织获取后需立即进行包埋，处理过程应尽快完成，确保组织的新鲜度。注：以脑组织为例，在记录灌注时间时，同时剪去动物头部皮肤准备开颅。ACSF灌注10分钟后，揭开硬脑膜观察灌注效果，准备取脑组织。取脑组织时，借助立体定位仪和显微操作器将脑组织沿正中矢状面分为左右半脑。先取下右半脑进行矢状面包埋。随后，在左半脑AP方向中点的位置，沿冠状面将左半脑一分为二，并立即进行左半脑的冠状面包埋。A.2.2动物组织样本直接包埋前处理动物组织样本包埋前处理步骤如下：a）针对不同组织可采用不同方式获取新鲜组织样本；b）将新鲜组织放入清洗液中清洗23次，去除表面杂质。清洗后需用无菌无纺布/无菌无尘纸擦干表面液体（如需要）；c）新鲜组织离体后需使用无菌无纺布/无菌无尘纸将组织表面的血迹或黏液等液体擦拭干净；注：如浸泡或清洗组织，需吸干组织表面液体，避免在组织表面形成冰块影响后续包埋切片。d）使用酒精对工具进行消毒并擦干；e）根据组织大小提前准备好合适的包埋盒，将样本剪切至便于包埋的尺寸；f）参照5. 2进行包埋。附录B（资料性）动物和植物组织切片厚度B. 1动物和植物组织切片厚度动物和植物组织切片厚度见表B. 1。表B. 1动物和植物组织样本切片厚度样本类型组织切片厚度动物脑10 u m心脏10 u m肾脏10 u m肺10 u m胃10 u m大肠10 u m小肠10 u m脾脏10 u m卵巢10 u m睾丸10 u m眼睛10 u m甲状腺10 u m股四头肌10 u m乳房10 u m20 u m植物叶芽10 u m叶、根、茎10 i m20 u m种子20 Hm附录c（资料性）FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法C. 1 FAA固定液福尔马林（38%甲醛）5mL冰醋酸5mL70%酒精90 mL甘油（丙三醇）5mL称取上述试剂，进行混合摇匀。C.2蔗糖-PBS溶液（3%）C. 2.1首先配制0. 5 x PBS缓冲液，不同体积的缓冲液配制见表C. 1。表C. 1 0. 5 x PBS缓冲液配制表组分名称缓冲液体积所对应的组分取样量5 mL10 mL100 mL10 X PBS缓冲液250 uL500 uL5 mL无核酸酶水补充至5 mL补充至10 mL补充至100 mLC. 2.2根据不同体积称取相对应的蔗糖重量，加入新的容器中，蔗糖重量称取见表C. 2。表C. 2蔗糖称取表组分名称缓冲液体积所对应的组分取样量5 mL10 mL100 mL蔗糖0. 15 g0.3 g3 gC. 2.3称取蔗糖后，加入配制好的0.5 xPBS缓冲液定容至对应体积，置于冰上预冷。注：0. 5 xPBS缓冲液加入蔗糖后体积会发生轻微变化，建议最后以定容体积为准。