国家自然基金申请书写作：蛋白检测篇6-双向凝胶电泳.docx

编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。蛋白质是两性分子，在不同的PH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH,此时蛋白质的静电荷为零，此PH值即该蛋白质的等电点（p1）。将蛋白质样品加载至PH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点PH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与PH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的P1值;在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS.PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。步骤：1 .样品制备2 .第一向分离等电聚焦3 .第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳3.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图:ProteomicsExperimenta1Workf1ow(2DGe1)蚤白斑点的切取第一向IEF电泳第二向SDSPAGE电泳图像采集和分析染色