“三板斧”在低限度杂质HPLC方法开发中的应用.docx

“三板斧”在低限度杂质HP1C方法开发中的应用1 .HP1C对杂质限度较低的方法开发思路主要是提高与浓度相关参数（杂质响应一前提下）：如杂质的浓度、进样体积等，但当改变这些条件无法达到要求时只能寻求其他高灵敏（MS）的检测器,但是开发一个质谱的方法比较有难度，且不容易普及。2 .峰高和峰面积是HP1C中最为常见的两个重要参数：峰高越高，代表着化合物有更好的信噪比；峰面积越大，在进行定量限重复性研究时会越简单。3 .超高效液相色谱的原理主要是针对谱带的展宽进行了优化：柱外管路进行改进（0.1mm内径）；色谱柱进行改进（多数将内径改为2.1mm,1.9um小颗粒）。4 .目前HP1C主要使用的色谱柱内径是4.6mm,如4.6*15Omm；4.6*25Omm规格等类型，相比较UP1C化合物峰的展宽会比较大，但是如果UP1C色谱柱在普通液相使用，一般仪器的压力又无法耐受。过程：1 .第一板斧：采用中间内径（3mm）色谱柱，提高杂质峰高，缩短运行时间问题：方法开发时，使用YMCTriartC18（4.6×50mm,5m）色谱柱，流速0.8m1min,流动相0.1%磷酸溶液四氯吠喃：乙睛（1:2）（10:90）,发现杂质的响应较低，灵敏度不够，见图1-A；解决方法：根据UP1C提高柱效的理论，我们采用了内径小一个规格的色谱柱YMCTriartC18（3.0×100mm,3m）,其他条件不变；测定见图1-B。结果：杂质峰高提高了近一倍，而且缩短了保留时间，提高了分析效率。2 .第二板斧：降低流速提高杂质的峰面积问题：经摸索发现更换高效的色谱柱后只提高杂质峰高，峰面积的响应没有变化（因杂质峰面积较小时重复性不好，定量限不好做）；同时该色谱柱内径较小，导致柱压过高，有超压风险。解决方法：根据紫外检测器（浓度型检测器）峰面积与流速的乘积为一常数这一理论，将流速降为0.6m1min结果：杂质峰面积得到提高，满足了定量需求；同时也将降低了柱压，进一步提升了小内径色谱柱在普通液相中的应用。3 .第三板斧：提高有机相比例，调整保留时间，进一步提高峰高。问题：流速降低虽提高峰面积，但导致杂质保留时间延后。解决方法：提高有机相比例为92%。结果:经调整流速和有机相比例后色谱图见图1-C,杂质保留时间在和图I-B一致的情况下，峰高和峰面积都得到了提高；同时也将降低了柱压。结论：采用更换3.0mm内径色谱柱+降低流速+提高有机相比例三板斧思路将杂质的峰高可以提高1-2倍，峰面积也得到增大（根据流速调整大小而改变），同时将分析时间缩短。该思路在杂质方法开发时运用较为简单，只有三板斧，试下就知道效果怎么样，可以应用在液体制剂的迁移物方法开发、化合物的限度较低的方法开发，对于清洁验证方法开发也比较实用。