16SrDNA测序结果分析.docx
16SrDNA测序结果分析2017-12-131测序结果文件一般公司DNA测序结果都提供两个文档，一个是序列文档（后缀为.seq）,一个是测序峰图文档（后缀.ab1）,为碱基的测序质量信息。（A） .seq-序列文件，TEXT的序列文档,可由记事本或BioEdit打（B） .ab1-峰图文件，可由BioEdit或ChrOmaS打开察看。A01.P20047_P250340a_7S1A_F-记事本ATCTTCTGTCTAGCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGCATTC(Ggggcacgctgcagacgatcctggggggtgtgaacaaa<ATnTTCGCATTATGATCcTCGTTGTGGcTGCAAAGGAGGGcagccaggctccaagaacgtgtgctacgatcactacttiTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTG<GAGATAAAGAGTGAAEAAGGACATCGAGGAGATCAAAA2 .切除两端低质量碱基由于Sanger测序技术限制，每个测序反应一般仅有800bp左右比较准确。一般测序结果的前端大约50个碱基的质量会不好（测序引物的原因），此部分测序峰图通常无法判读。这是正常现象，需要把此部分碱基切除。同理，测序后期的碱基质量也比较差（酶活降低与杂质干扰较大等原因），也需要把尾部测序峰图不规则的碱基切除。因此留下中间碱基质量相对较好（峰图规则）的序列用于后续分析。方法如下： 用BioEdit打开正向测序结果峰图文件（ZB10100433（yangpin1）16SS（ZidaiIPW_G12.ab1）,通过移动左边与左上角的比例标尺，调整峰图的高度与宽度，使DNA每个碱基的峰图大小适合观察。 从下图看出，前面50多个碱基的峰较乱，此处选择55个开始的碱基。同理，DNA末端由于酶活力下降等原因，测序质量也逐步变差。根据峰图的形状，我们也需要切除尾部950bp后的碱基（约末端100bp）r只保留56-950之间约900bp的高质量碱基。 选择BioEdit显示DNA序列的子窗口(WindOW菜单->DNAsequencefrome.) 然后在BioEdit的Sequence->se1ectPc)SitiOnS,在弓单出窗口中输入56与950,点OK按钮后，就以背景黑的显示已选择的序列。 再选edit菜单->Copy(或直接按Ctr1-C键)，复制序列到一个新的文本文件，保存为16S_rDNA.faso增加序列的注释行>16SF”,代表正向测序序列。 同上步骤，根据峰图信息，再复制另一个反向测序结果的高质量序列(56-950)到文本文件16S_rDNA.fas,并标记序列为>16SR",代表反向测序序列。DNA测序通常需要两个方向进行，测序都是从DNA的5'端到3'端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序。双向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠DNA测序结果。3 .双向测序序列的合并通常PCR产物双向测序，需要合并双向序列，最终得到全长序列，这样得到DNA序列比较准确。.BiOedit打开前面保存的16S,DNA.fas°由于第二条序列是反向测序得到的DNA反向互补序列，需要通过先得到DNA的反向互补序列：Sequece->Nu1eicAcid->ReverseComp1ement,再进行比对。利用BioEdit的a1ignment功能找重叠区域:ACCeSSoryapp1ication->C1usta1Wmu1tip1ea1ignment,使用默认设置，比对结果显示，中间重叠部分的序列大部分相似。如果重叠区不是大部分相同碱基，请试着把一条序列反向互补，再比对。4 .碱基的校准在上一步的比对结果窗口,先利用BiOEdit得到两条件序列合并后的一致序列： A1ignment菜单->CreateConsensusSequenceo 如是中间重叠区有少部分碱基不一致，可根据对应的峰图文件ab1的质量信息，修改碱基。修改碱基前，需要先把bioedit的Mode设置为Edit"与Insertw,并选中按钮"viewconservationp1ottingidentities.withadot”,以点显示相同的碱基，便于观察差异位点。 在BioEdit中打开正向和反向测序结果的AB1文件和上面比对结果放同一窗户（如图）。 定位到差异碱基的位置（下图黑色部分）,一般可以在峰图文件中查找不一致碱基（正反链错配、缺失或误增碱基）及附近的几个序列（点击Edit菜单->find,或直接Ctr1-F）,如查找GCAtACo注意反向测序峰图的搜索，需要输入序列的反向互补序列（GTtTGC）,小写字母为不一致碱基。 查看该碱基及附近碱基正反测序峰图形状，判断该碱基正确的碱基序列。 然后在序列窗口中分别改正正向16SF、反向16SR及Consensus序列中不一致的碱基。如有空格(gap)显示为-，需要把三条序列同一位置上的碱基与-都删除，才能保持后面的碱基比对结果正常(BaCkSPaCe可删除光标前一个碱基)。EtMSequmceAftgnmentytor-°O在BioEdit中打开正向和反向测序结果的AB1文件和上面比对结果放同一窗户（如5 .保存序列保存校正后的consensus序列，即为最终测序结果的合并序列。 选择concensus序歹（->鼠标右键:COPysequences 点击fi1e菜单->新建A1igment 点击Edit菜单->pastesequence,并点击COnCenSUS的标题改为16S,rDNAw 然后保存为16S_rDNA.fas（文件类型选择Fasta格式）W4fUGX心力短也|闻1Q0X小>16SjDNA.GGGAGTGGGGGCATGCnACCATGCAAGTCGCACGAAGGECGGCCTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGTATeTATCeATGGGTGGGGGATAACACTGGGAAACCGGTGCTAATACCGCATGACACCTGAGGGTCAAAGGCGCAAGTCGCCTGTGGAGGAGCCTGCGEGATTAGCTAGTGGTGGGGGGTAAAGACTATATGCGATGATCATAGGCTGGAGAGATGATCAGGCACACTGGACTGAGACACGTCCAGACTCTACGGGAGCAGCAGTGGGGGAATATGACAATGGGGGCACCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACECGACGGGGACGATGATGACGGTACCCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGeTAGCGTTGCTeGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCGTGTAGGcGG1TrGTAcAGTcAGATGTGAAATccccGGGcnAAcATGGGAGcTGcATGTGATACGTGCAGACTAGAGTGTGAGAGAGGGnGTGGAAnccCAGTGTAGAGGTGAAAncGTAGATAnGGGAAGAAcAccGGTGGcGAAGGcGGcAAccTGGcTcAnACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAeCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTGTGcrAGATGTTGGGTGAEAGTCATTCAGTGTCGCAGTTAACGCGTTAAGCACACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGGAAACTCAAAGGAAGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTAACGAAGCAACGCGCAGAACCACCAGGGCGAATGTAGAGGCTGCAAGCAGAGATGTGTCCCGCAAGGGACCTCTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGnGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCEAGTTGCeATCAGGTTGGGCrGGGCACTCTAGAGAGAeTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGAAGCTAGGTGGTGACACCATGCTGATCTCTAAAAGCCGTCTCAGTTCGGAGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCA
