花生品种纯度鉴定技术规程.docx

花生品种纯度鉴定技术规程-SSR标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列(SimPIesequencerepeat,SSR)标记法进行花生(Arachishypogaea1.)品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、操作步骤、判定方法与原则。本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程杆样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。品种纯度Varietypurity品种在SSR标记带型上典型一致的程度，反映鉴定品种的特征特性。简单重复序列Simp1esequencerepeat(SSR)由几个核昔酸(16个)为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp(一般为100200)的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。推荐引物Recommendedprimer根据最少引物区分最多品种的原则，筛选出多态性高，条带清晰、重复性好的一套SSR引物。参照品种Referencevariety具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。4原理不同花生品种由于遗传组成不同，基因组中重复单位的数目存在差异，造成了品种间的多态性。可根据其两端的高度保守序列设计特异引物，通过PCR扩增及电泳检测，从而鉴定花生品种的纯度。5仪器设备高压灭菌锅（105C136,最大工作压力0.22MPa）；凝胶自动扫描仪（400百万像素）；高速冷冻离心机（最大离心力不小于1500Og）；PCR扩增仪（00C-IOOeO；紫外分光光度计（波长19OninIIoOnm）；恒温水浴锅（室温99）；水平摇床（Orpm-230rpm）；微波炉（耐温120）；电子天平（最小显示0.0Ig）；电泳槽（样品通量1OInm厚）；磁力搅拌器（Ormin2500rmin,室温100）；酸度计（-2.0020.000PH）；微量移液器（2K101>100k200k5001和移001）。6试剂乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）；三羟基甲基氨基甲烷（TriS）；盐酸（HC1,36%）；十六烷基三甲基漠化镂（CTAB）；氯化钠（NaC1）；硼酸（Borate）；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；四甲基乙二胺（TEMED）；无水乙醇；过硫酸钺（APS）；硝酸银（AgM）；X脂糖；6×1oadingbuffer；Go1dVieW染料;RNAasedOug11）;酚：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1）；异丙醇;四硼酸钠；甲醛；2×FrementsMix；SSR引物（10mo111）:20bpDNA1adder；重蒸水或符合GB/T6682规定的一级水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。7溶液配制相关溶液配制方法见附录A。8引物信息推荐引物的序列信息与等位变异见附录丸9操作步骤9.1 样品准备鉴定样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。随机取100粒花生种子，取其父母本材料各10份，另取参照品种（见附录C）各2粒。水培法种植，至第三片真叶长出后备用。9.2 单粒种子的DNA提取9.3 2.1DNA提取取单株幼苗的根、茎、叶等器官50mg,放入15m1,离心管中，液氮研磨。CTAB法提取基因组DNA,加入1001IxTE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入51RNAase,37温育1h,-20保存留用。9.2.2DNA浓度和质量检测测定DNA溶液的05(。值，确保在172.O范围内。测定其ODzw的吸光度，以1个ODzm值相当于50mg1,DNA浓度来计算纯化DNA的浓度。用0.8%X脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Go1dVieW染料进行染色。稀释至工作浓度为30ng1,置于4备用。9.3PCR扩增9.3.1反应体系总体系为101,包括1.51DNA,1.91水，512×FrementsMix,0.81F/R引物，混匀。9.3.2反应程序95预变性3min；95变性45s,55退火45s,72延伸45s,进行35个循环；72延伸5min；4保存备用。9.4PCR产物检测9.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶制备9.4.1.1玻璃板组装清洗玻璃板和52齿梳，晾干；用95%乙醇擦凹板和平板，两板间插入1Omm厚的边条，对齐，夹紧，凹板朝上，水平放置，用水平仪调平。9.4.1.2灌胶在小烧杯中加入7.5m16%聚丙烯酰胺凝胶溶液、37m1水，然后加500110%APS及201TEMED,轻轻摇匀，防止产生气泡；迅速灌胶，将梳子齿朝外，轻轻插入胶中，至凹板玻璃面约0.8Cm处，静置1ho9.4.2电泳检测9.4.2.1玻璃板组装将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入IXTBE缓冲液，至下槽液面约为槽高的1/3,上槽液面高于凹板玻璃面约1Cnu9.4.2.2清洗胶孔拔去梳子，冲洗胶孔，赶走底层气泡和杂质。9.4.2.3上样在101PCR产物中加入216×1oadingbuffer,用微量移液器上样，每孔加入21PCR扩增产物；同时，在两侧样品孔中加入20bpDNA1adder分子量标记。9.4.2.4电泳电压为200V,根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示剂到达胶板的2/3处，停止电泳，电泳时间约2ho9.4.3.1水洗电泳结束后，分开两块玻璃板取出凝胶，用水漂洗10S20s,重复2次。9.4.3.2银染转移至400m10.1%AgNO3溶液中,在摇床上轻摇10min。9.4.3.3水洗从染色液中取出，在水中快速漂洗2次，时长8S-IOSo9.4.3.4显影转移至400In1显色液中，在摇床上轻摇至带纹清晰，用水冲洗至溶液澄清。9.4.3.5成像将凝胶置于凝胶成像工作台，选用透射UV光，调节f。CUS至图像最清晰，保存。10判定方法与原则10.1 判定方法10.2 每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示，利用凝胶分析软件QUantityOne读取条带。比较每份样品在每个位点的等位变异，统计带型。用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如式1：10.3 判定原则如差异位点数=0,则说明该品种纯度为100%,判定为“单一品种”；如差异位点数=1,判定为“姊妹系”或“基本稳定品种”；如差异位点数22,则判定为“混合样品”。AA附录A(规范性附录)溶液配制A.1DNA提取试剂A.1.11mo11-'NaOH4gNaOH,加水定容至100m1oA.1.21mo11,Tris-C1(PH8.0)溶液称取121.1gTris,加水定容至11,浓盐酸调至PH8.0,高压灭菌备用。A.1.30.5mo111EDTA(pH8.0)溶液称取186.1gEDTA-Na2,800m1水,加热定容至11,1mo111NaOH调至PH8.0,高压灭菌备用。A.1.41×TE1 m11mo111Tris-HC1(PH8.0),0.2m10.5mo111EDTA(PH8.0),力口水定容至100m1oA.1.5DNA提取液4gCTAB,16.364gNaC1,20m11mo11,Tris-C1(PH8.0),8m10.5mo111EDTA(PH8.0),加水定容至200m1,4C条件下保存。使用前加入2%的疏基乙静，实验前预热至65C。A.2聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂A.2.170%乙醇700m1无水乙醇，加水定容至11oA.2.2IoXTBE缓冲液分别称取108g三羟基氨基甲烷，55R硼酸，加入800m1水加热溶解，再加入0.5mo11,EDTA(PH8.0)溶液37m1,加水定容至11oA.2.3IXTBE缓冲液100m1IOxTBE,加水定容至11A.2.410%APS0.5gAPS溶于5In1水中。A.2.56%聚丙烯酰胺凝胶溶液(29:1)分别称取58g丙烯酰胺，2g甲叉双丙烯酰胺，IOOm110×TBE,加水定容至11,4条件下保存。A.2.6染色液称取1g硝酸银，加水定容至11oA. 2.7显色液6gNaOH,0.2g四硼酸钠，16m1甲醛,加水定容至400矶。BB附录B（资料性附录）推荐引物B. 1推荐引物见表BJ。表B.1推荐引物序号引物连锁群引物序列（5，-*3,）常见等位变异bp参照品种8GM1996B03F-catcccatcattttccctcttR-tacagtgaaggtgggatcctg7777/9285878992zh.h5034zh.h2477zh.h5327zh.h1395zh.h2764zh.h24059GM2638A04F-atgctctcagttcttgcctgaR-CagaCataaCagtCagtttcacc45555763656969/7373zh.h1689zh.h2702zh.h2384zh.h4749zh.h5327zh.h2250zh.h1843zh.h094910GNB317未定位F-gaaaagcttgcaaaatcgagaR-tccttccatgttggtgaatg188194197200203212224227230zh.h2550zh.h0540zh.h2561zh.h2405zh.h2764zh.h5034zh.h2462zh.h0537zh.h474911GNB357未定位F-aggtttgctttgggatgatgR-ccgataaaaccaggcaagaa191191/203194197203215218zh.h5034zh.h0436zh.h1602zh.h2406zh.h0537zh.h0861zh.h1331表B.1推荐引物（续）序号引物连锁群引物序列（5'-3,）常见等位变异bp参照品种12GNB556AO1F-IcagggtgggttaccaacatR-taatccacattgaaccgacg5656/71626871778086zh.h0525zh.h5327zh.h0934zh.h2413zh.h2410zh.h0868zh.h2231zh.h133113PM308未定位F-ccttcttctttctcctcctcaR-Caattcgtgatagtattttattggaca64747880828692zh.h5034zh.h4749zh.h0977zh.h2764zh.h2464zh.h2405zh.h0680MpPGPseq2C11A03F-IgacctcaattttggggaagR-gccactattcatcgcggta385403418439450461zh.h