胃蛋白酶Pepsin试剂盒说明书.docx
胃蛋白酶(PePSiII)试剂盒说明书微量法IOOT/48S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：胃蛋白随由胃粘膜主细胞分泌，分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别，慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。渊定原理：胃蛋白酶可能化血红蛋白水解，水解产物与福林试剂反应后显蓝色；一定范围内，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。自备仪器和用品：可见分光光度计/酷标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸饱水。试剂组成和配制：试剂一：液体IoOm1X1瓶，4保存。试剂二：液体20m1X1瓶，4匕保存。试剂三：粉剂X1瓶，4C避光保存。临用前加入IOm1试剂二充分溶解。试剂四：粉剂X1瓶，4C保存。临用前加入IOm1蒸馅水充分溶解。试剂五：粉剂X1瓶，4C保存。临用前加入15m1蒸镭水充分溶解。试剂六：液体3.3m1X1瓶，4C保存。标准品：液体127m1X1支，0.5mo1m1酪氨酸标准溶液浓度4保存。粗酶液提取：组织样品：按照组织质量(g)：试剂一体积(m1)为I：510的比例(建议称取约0.1g组织，加入Im1试剂一)冰浴匀浆，8000g,4C离心IOmin,取上清，即粗酶液。渊定步骤：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到580nm,蒸耀水调零。2 .试剂三和试剂四置于37水浴预热30min.3 .标准管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入201标准品，401试剂二，1201试剂五，201试剂六,混匀后室温静置20min,于580nm测光吸收，记为A标准管。4 .空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入201蒸溜水，401试剂二，1201试剂五，201试剂六，混匀后室温静置20min,于58Onm测光吸收，记为A标准空白管。5 .对照管：取EP管，加入100U1蒸镯水，置于37水浴保温IOmin；加入IOOU1试剂四，盖紧后摇匀Imin；加入20I11粗麻液，混匀后8000g4C离心IO分钟取上清：在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液201,再加入40U1试剂二，12On1试剂五，20U1试剂六，混匀后室温静置20min,于58Onm测光吸收，记为A空白管。6 .测定管：取EP管,力口入201粗酶液，IOoH1试剂三,6于37C水浴保温IOmin；加入1001试剂四,盖紧后摇匀Imin；8000g4离心10分钟取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20U1,再加入401试剂二，1201试剂五，201试剂六，混匀后室温静置20min,于58Onm测光吸收，记为A测定管。注意：空白管和标准管只需要测定一次。计算公式：a.使用微火玻璃比色皿测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算活性单位定义：37每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成Inmo1酪氨酸为1个酶活单位。胃蛋白酶活性（nmo1/min/mgpro1）=C标准品X（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）X稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T=27500×（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）÷Cpr（2）按样本质量计算活性单位定义：37T每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成Inmo1酪氨酸为1个酶活单位。胃蛋白酶活性（nmo1/min/g鲜重）=C标准品X（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）x稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=27500×（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）÷WC标准品：标准品浓度，0.5mo1m1酪氨酸：稀粽倍数：（20+100+100）÷20=11:Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mgm1）,需要另外测定：VI：加入反应体系中粗酶液体积（m1）,201=2×102m1;W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（m1）,1m1；T：催化反应时间（min）,10min<,b.使用96孔板测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算活性单位定义：37。C每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成Inmo1酪氨酸为1个酶活单位。胃蛋白酶活性（nmo1/min/mgprot）=C标准品X（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）X稀释倍数÷（CprxV1）÷T=27500×（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）÷Cpr（2）按样本质量计算活性单位定义：37tC每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成Inmo1酪氨酸为1个酶活单位。胃蛋白酶活性（nmo1/min/g鲜重）=C标准品X（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）X稀释倍数÷（W×VI÷V2）÷T=27500×（A测定管一A对照管）÷（A标准管一A空白管）÷WC标准品：标准品浓度，05n>1m1酪氨酸：稀释倍数：（20+100+1（X）÷20=1hCpr：粗酶液蛋白质浓度（mgm1）,需要另外测定；VI：加入反应体系中粗酶液体积（m1）,201=2×10-2m1:W：组织质量（g）：V2：粗酶液总体积（m1）,1m1：T：催化反应时间（min）,IOmino注意事项试剂三、试剂四、试剂五临用前配制，配制好用不完的试剂4C可保存一周。优利科（上痔生酣科学先用
