布鲁氏菌病抗体试管凝集试验.docx

布鲁氏菌病抗体试管凝集试验1 .原理：在微生物学检验中常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为滴度。在试验中，由于电解质浓度和PH不适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。2 .试剂：0.5%石碳酸生理盐水、布鲁氏菌试管凝集抗原、标准阳性、阴性血清。3 .设备耗材：试管、试管架、吸管、微量移液器、吸头、温箱。4 .操作步骤：4.1受检血清的稀释：以羊血清为例，每份血清用4个连续的U型孔；在96孔U型反应板的第1孔加184U1稀释液，第24孔内各加入IOO1I1稀释液。用移液器取受检血清161加入第1孔内并混匀，从第1孔吸取IOOu1混合液加入到第2孔充分混匀，如此倍比稀释至第4孔，从第4孔弃去混合液IOoU1。稀释完毕后，从第1孔至第4孔的血清稀释度分别为1：12.5、1:25、1:50和1:100。牛血清稀释法与上述基本一致，差异是第1孔加192U1稀释液和8U1受检血清，其稀释度分别为1:25、1:50、1:100和1:200。4.2分别取稀释好的抗原1001加入上述各孔稀释好的血清中，并振荡混匀，羊的血清稀释度则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200,牛的血清稀释度则依次变为1:50、1：100、1:200和1：400o4.3将加完样的96孔反应板用塑料薄膜严密封盖后，放湿盒内置电热恒温水浴锅（37七±1。C）中孵育18-24h,取出检查并记录结果。4.4试验应设立阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照，即：阴性血清对照和阳性血清对照对照试验中稀释和加抗原的方法与受检血清的相同。抗原对照抗原按照说明书稀释到规定容量，取IOOu1,再加IO01稀释液，观察抗原是否存在自凝现象。凝集反应程度：凝集反应程度分为5个等级，分别记为“+，“+，、“+”、“+”和”按以下说明进行判定：+：菌体完全凝集，1孔4孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底；+：菌体几乎完全凝集，1孔3孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，第4孔孔底呈现白色点状沉淀；+：菌体凝集显著，1孔2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，3孔4孔孔底呈现白色点状沉淀；+：凝集物有沉淀，第1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，2孔4孔孔底呈现白色点状沉淀；-：无凝集，14孔孔底呈现白色点状。5.试验有效性判定：阳性血清出现完全凝集（+）,而阴性血清无凝集（-），且抗原对照无自凝现象（-）时，试验成立。6.结果判定：牛、马、鹿和骆驼1：IOO血清稀释度，猪、山羊、绵羊和犬1:50血清稀释度，出现“+”及以上凝集现象时，判定为阳性；牛、马、鹿和骆驼1:50血清稀释度，猪、山羊、绵羊和犬1:25血清稀释度、出现“+”及以上凝集现象时，判定为可疑；结果可疑的经30d后采血重检，如果仍为可疑，该牛、羊判定为阳性。猪和马经重检扔保持可疑水平，而农场的牲畜无临床症状和大批阳性患畜出现，则判定为阴性。备注：每次试验均需配比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将已经稀释好的工作抗原用等量稀释作对倍稀释，然后按照下表进行比浊管的配置。比浊管配置管号对倍稀释后的抗原液/1稀释液/U1清亮度/%记录标记101000100+225075075+350050050+÷475025025+5100000