实时荧光定量PCR技术的原理及应用.docx

实时荧光定量PCR技术的原理及应用（图）一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念:（D扩增曲线：横坐标,扩增循环数（Cyde）,坐标*荧光强每个循环进行一次黄光信号的收集（2）荧光阈值:荧光信号阂值(thresho1d):前15个播坏信号作为荧光本底信号(base1ine),叩样本的荧光背景值和明性薜照的荧光健口荧光域J的骐省设置是3T5个循环的荧光的标准原差的10倍Z!手劫设置:原则要大于样本的荧光背景值和阴性时照的荧光最高值-同时要尽量选择进入指数期的最初阶段并且保证回归系数大卜399口真正的信号荧光信号超过域值Ct值:Ct值的定义言PCR扩增过程中'扩增产物的荧光信号达到设定的阚值时所经过的扩增循环次数CT值的重现性：Ct值的特点*相同模板进行9欲扩增，终点处产物量不恒定;Q值则极具重现性5、定量原理：理想的PCR反应：X=Xe*2n非理想的PCR反应：X=Xo(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线口模板DNA量越参-荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小1og浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标推曲线，根据样品Ct值”就可以计算出样品中所含的模板量6、绝对定量1)确定未知样品的C(t)值2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBRGreen法（一）工作原理1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA,SYBRGreen发荧光，在此阶段米集荧光信号Tm值：DNA解链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导。(-d1jd1)口模板DNA量越如荧光达到域值的循环数越少口1og浓度与循环数呈线性关系'根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量袖相曲球分析.篮一峰无非特异性黄咒定以港瑚魄解曲统分析卜出现杂峰其他产物出现非精异性荧光,因此定量不准/PCR反应体系的建立及优化:1、SYBRGreen使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太1DgOfQXACORE八ni-mtiQn低，荧光信号太弱，不易检测2、PriIner:引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgC12的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer体系的优化5、反应温度和时间参数：由酣和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定：2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对Pri1ner的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA：使用方便：不必设计到杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件：对引物特异性要求较高。方法二：T叫Man水解型杂交探针J1与目兼序列互补*5'端标记有报告基11（Reporter,R）,如FAM、VIC等*3'端标记有荧光淬灭基团（QUenCher,Q）”探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，*Taq酶有5'3'外切核酸能活性，可水解探针（一）工作原理无荧光，R与Q分开，发荧光Q''&iicIIfIiAr注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70r,<30bp,5'不能有G.G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp,引物Tm为59-60r2、反应参数的确定：一般为：94r,10-20S60r,30-60S（Taq1W5'3'外切核酸酶活性在60r最高）也可通过温度梯度优化退火温度72r,45S,3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值引物浓度：5Q-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：对目标序列的1¾特异性阴性结果确定设计相对简单与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高1不易找到本底低的探针