DB6505T 1292023省际公路检查站小反刍兽疫监测技术规程.docx

ICS65.020.30CCSB41B6505哈密市地方标准DB6505/T1292023省际公路检查站小反刍兽疫监测技术规程Monitoringtechniquesofpestedespetitsruminantsatprovincia1highwaycheckpoint2023-12-30实施2023-11-30发布哈密市市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由哈密市哈密市动物疫病预防控制中心提出。本文件由哈密市农业农村局归口。本文件起草单位：哈密市动物疫病预防控制中心、伊州区动物疫病预防控制中心本文件主要起草人：杨康、古丽巴哈尔卡德尔、杨夷平、阿达来提尤素甫、段进刚、关团、汪强荣、李欣宇。本文件实施应用中的疑问，请咨询哈密市动物疫病预防控制中心。对本文件的修改意见建议，请反馈至哈密市动物疫病预防控制中心（哈密市八一路奥科花苑）、哈密市市场监督管理局（哈密市前进西路14号）。哈密市动物疫病预防控制中心联系电话：0902-2317228,传真：0902-2317228,邮编：839000哈密市市场监督管理局联系电话：0902-2250279,传真：0902-2251069,邮编：839000省际公路检查站小反刍兽疫监测技术规程1范围本文件规定了小反刍兽疫临床诊断、样品采集、实验室检测、疑似小反刍兽疫结果的处理以及消毒的技术要求。本文件适用于哈密市域内公路检查站小反刍兽疫的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27982小反刍兽疫诊断技术3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。21小反刍兽疫estedespetitsruminants俗称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。荧光实时定量反转录-聚合酶链反应rea1-timequantitativereversetranscriptionpo1imerasechainreaction在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Ct值Ctva1ue是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4临床诊断A1临床症状4.1.1 羊体温上升到4042.4.1.2 羊眼、鼻大量排出水样分泌物或脓性的结干并发出恶臭。呼吸急促，呼吸困难，排痰性咳嗽或眼睛卡他性分泌物。4.1.3 羊口腔粘膜充血，口腔上皮和鼻腔粘膜有大量部分粘连的极微小的略灰色坏死点，坏死组织脱落后形成界线分明的浅糜烂斑。上皮破损偏好部位为嘴唇、齿龈、牙板、舌头以及母羊阴户的阴唇表面，口腔破损可能伴有大量流涎。4.1.4 一些病情严重的羊，会出现严重腹泻或下痢。49病理变化4.2.1口腔和鼻腔黏膜糜烂坏死。4. 2.2肠可见糜烂或出血，盲肠、结肠近端和直肠出现特征性条状充血、出血，呈斑马状条纹。4.2.3可见淋巴结特别是肠系膜淋巴结肿大，脾脏肿大并可出现坏死性病变。41结果判定出现上述临床症状和病理变化的,可判定为疑似小反刍兽疫。确诊需要做病原学检测和血清学检测。5样品采集K1采样原则按照预期个体流行率6%,10%可接受误差，90%置信水平条件下，依据运载车辆的载羊数确定每辆车羊只抽检数量（见表1）。若发现有疑似临床症状或者死亡的动物必须全部采集。表1羊只抽检数量车载羊数（只）抽样数量（只）50-9912100-19914200-89915勺）采样要求5.2.1拭子样品无菌采集羊的眼棉拭子和鼻棉拭子各3份，放置于装有1.5血,磷酸盐缓冲液（或生理盐水）保存液的2In1离心管内，且眼棉拭子与鼻棉拭子要一一对应。5. 2.2组织样品无菌采集刚病死样的肺、淋巴结和脾脏，每份样品体积为3mmx3mmx5mm.5. 2.3信息采集对样品做好标记，并填写动物样品采集登记表（附录A）oR1样品接收5. 3.1查看采样记录单是否填写完整、是否签字确认。5. 3.2查看样品是否合格，重点看棉拭子样品的保存液是否足够，看组织样品采集部位是否符合检测要求、有无变质腐败，样品标记是否清晰。5. 3.3填写样品接收登记表（附录B）。区4样品处理5. 4.1填写合样记录表（附录C）。5. 4.2将棉拭子充分捻动或旋涡震荡40s,待拭子上的附着物完全溶于液体，挤干后弃去棉拭子。5. 4.3震荡后，若样品较为浑浊或杂质较多时，要用离心机以300Og离心3min,取上清作为待检样品。5. 4.4每个样品取IOO1进行合样（原则上不超过10个，且不同车辆之间，禁止混样），按照核酸提取试剂盒要求，抽取一定体积的待检混样进行下游实验。6实验室检测A1检测方法采用小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR方法进行检测。A0病毒核酸提取6.2.1 应用市售商品化柱式抽提试剂盒，按使用说明书人工提取病毒核酸。6.2.2 应用市售商品化自动提取试剂盒，按使用说明书在自动核酸提取仪上进行编程并提取核酸。Aa荧光RT-PCR反应体系推荐荧光RT-PCR反应体系为251,依次加入12.51的缓冲液，11上游引物，11下游引物，1 1反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液，0.51的荧光探针，41无酶水，51RNA模板。若选用商品化小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，可根据使用的产品说明调整反应体系。A4荧光RT-PCR扩增反应6.4.1每次进行荧光RT-PCR扩增时均要设立标准阳性、阴性、空白对照。6.4.2推荐荧光定量RT-PCR反应条件为：55C反转录30min,95C15s；9530s,60C30s；在每个循环的第二步（6030s）收集荧光信号，共40个循环。若选用商品化小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，可根据使用的产品说明调整反应条件。AK判定标准6.5.1读取每个样品的Ct值。6.5.2阳性对照Ct值30并出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线，实验结果成立。AA检测结果判定6.6.1未知样品有特异性扩增曲线且Ct值W40,判定实时荧光RT-PCR扩增为阳性，即检测出样品中含有小反刍兽疫病毒核酸。6.6.2未知样品有特异性扩增曲线且Ct值40,判定实时荧光RT-PCR扩增为阴性，即未检测出样品中含有小反刍兽疫病毒核酸。A7检测结果反馈6.7.1详细填写检测结果记录单（附录D）o6.7.2若RT-PCR检测结果为阴性，将检测结果直接报告给本站负责人。6.7.3若RT-PCR检测结果为阳性或者可疑，可判定为疑似小反刍兽疫。并将结果报告给本站负责人，并填写疑似阳性样品登记表（附录E）,做好相关信息登记，以便溯源和备案。6.7.4同时将疑似阳性样品送往哈密市动物疫病预防控制中心复检并报备。6 .7.5复检阳性样品送往自治区动物卫生监督所进行再次复检，并送往国家参考实验室确诊。7疑似小反刍兽疫结果的处理7 1初步处理对疑似小反刍兽疫车辆、家畜实施隔离、监控，禁止家畜、运输人员随意移动，并对其外环境进行严格消毒。8 ）疫情处置有临床症状，且经国家级实验室确诊为小反刍兽疫阳性的，按照国家小反刍防治技术规范和疫情处置要求，立即对检测结果为阳性的羊及同群羊进行扑杀和无害化处理，对车辆进行严格消毒。8消毒A1场地及设施消毒对车辆停泊场所、抽样场所、检测场所以及相关设施，可采用氢氧化钠、氯化物清洗、喷洒等方式消毒。fit）防护物品消毒衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒。ft1工作人员消毒参与相关工作的人员，用消毒液进行清洗消毒。附录A（资料性）动物样品采集登记表采样时间：一年月日时分No:（检疫证编号）采样地点车牌号动物种类车载总量畜主签字联系方式输出地车主签字联系方式输入地免疫情况免疫日期生产厂家疫苗名称及批号肺、淋巴结和脾样品种类眼鼻拭子肺脾淋巴结血清样品数量途中有无装卸装卸时间、地点样品编号装车部位耳标号是否有发病症状品种年龄样品种类（打勾）否是（具体写）眼鼻拭子肺脾淋巴结血清采样人:联系电话:附录B（资料性）样品接收登记表序检测记录单编号受检车辆动物种类样品名称样品数量接收日期原始编号签字确认备注注,检测记录单编号具有唯性，每辆受检运输车给予个编号，编号原则：年份+月份一JXXXX,J表示监督检测，XXXX为序号，从OoO1开始，直至本月结束，次月再从OOO1开始编号。编号形式，如202301JOOO1。附录C（资料性）合样记录表序号检测记录单编号合样编号原始编号合样日期合样人备注“注：不同车辆之间禁11二混样。附录D（资料性）检测结果记录单检测记录