2023结核病实验室诊断技术研发进展完整版.docx

2023结核病实验室诊断技术研发进展(完整版)摘要结核病的精准防控需要快速、准确的实验室诊断技术。自1882年罗伯特科赫发现结核分枝杆菌以来，结核病诊断技术经历了从传统的病原学诊断到免疫学和分子生物学诊断的巨大飞跃，然而这种诊断技术的发展仍然与实现2035年终止结核病的宏伟目标存在一定差距。作者在梳理既往结核病诊断技术研发进展的基础上，围绕结核病防控的核心诊断需求，探究未来实验室诊断的重要发展管线。关键词：分枝杆菌，结核；分子诊断技术；感染；诊断结核病是全球公共卫生面临的重大挑战之一。世界卫生组织(WOr1dHea1thOrgnization,WHO)2023年全球结核病报告指出，2023年全球有新发结核病患者1060万例，其中分别有超过90%和63%的患者来自于30个结核病高负担国家和一带一路国家。我国作为耐多药结核病(mu1tidrug-resistanttubercu1osis,MDR-TB)及利福平耐药结核病(rifampicin-resistanttubercu1osis,RR-TB)高负担国家，2023年结核病发病约78万例，其中MDR/RR-TB患者约3.3万例，在30个结核病高负担国家中列第3位，仅次于印度和印度尼西亚，占全球发病患者数的7.4%o我国的结核病防控形势依然严峻，实现终止结核病策略任重道远。结核病防治面临诸多挑战，其中，结核病实验室诊断不足严重制约了患者的发现，造成患者的诊治延误和结核病的人际间传播。WHO统计数据显示，我国仅有58%的肺结核患者具有细菌学实验室证据，低于全球平均水平，其余肺结核患者的诊断依靠临床表现及影像学证据，缺乏特异性。仅依靠医生的经验开展诊断易造成误诊、过诊和漏诊,迫切需要快速、准确、价廉的诊断技术为结核病患者诊断提供实验室证据。结核病实验室诊断基于不同样本类型，使用病原学、分子生物学、免疫学等多种方法发现患者标本中结核分枝杆菌及其耐药性证据，为临床医生提供结核病诊断和治疗依据。痰涂片和培养是目前应用最广泛的结核病实验室诊断技术，但较低的敏感度极大地限制了对结核病患者的阳性检出率。近年来，随着分子生物学技术的突飞猛进，涌现出一批用于结核病早期诊断的快速诊断技术,例如GeneXpertMTB/RIF.DNA测序等,分子生物学检测技术极大地补充了传统细菌学诊断方法。WHO报道，从2000年到2019年全球结核病的致死率降低了41%,尽管如此，仍然有300万例患者被漏诊，这说明当前结核病实验室诊断远无法满足临床需求。在结核病高负担国家中，不同结核病患者数量分布导致结核病疫情负担呈现不同特点。因此，各国对结核病实验室诊断技术的主要需求也各不相同。在中低收入国家中分为3大类：第1类为结核病高负担国家，如印度、印度尼西亚、中国等8个国家的结核病负担合计占全球的2/3以上，以结核病患者数多、结核分枝杆菌潜伏感染人群数量巨大为特点，亟需用于结核病患者筛查发现的诊断技术满足其临床需求；第2类为耐药结核病高负担国家，如俄罗斯联邦、孟加拉国、安哥拉等，亟需补充完善耐药结核病诊断和用于疗效评价的诊断技术；第3类为TB/HIV双重感染高负担国家,如博茨瓦纳、喀麦隆、几内亚等，以TB/HIV双重感染患者居多，HIV感染造成的免疫缺陷继发结核感染比例较高，因此，这类国家亟需解决TB/HIV双重感染者中结核病患者的诊断及潜伏感染的诊断难题。与上述国家的基本情况有所不同，虽然作为结核病的高负担国家，我国的结核病发病率低于全球平均水平，但是在发现患者中处于疾病早期阶段的患者比例较高，亟需用于临床诊断结核病患者的适宜检测工具，以实现菌阴肺结核的早发现、早诊断、早治疗，从而极大地改善患者预后，减轻社会经济负担，实现终止结核病。一、结核病实验室诊断技术发展的历史沿革(-)国际结核病诊断技术的历史沿革1.结核病细菌学诊断领域历史沿革：1882年罗伯特科赫发现结核分枝杆菌后，痰涂片镜检技术以操作简单、成本低等优点，成为沿用至今的重要的结核病筛查工具。但是基于萋-尼(Zieh1-NeeISen,Z-N)抗酸杆菌染色的普通光学显微镜检查需要每毫升痰标本中结核分枝杆菌浓度达到10OOO条菌以上方能检出，耗时耗力，且敏感度较低；随着荧光染色技术的发展，基于金胺O荧光染色的传统荧光显微镜(FM)和发光二极管荧光显微镜(1ED-FM)检查逐渐应用于临床结核病患者的发现和随访疗效监测，荧光显微镜的使用提高了检测敏感度并极大缩短了检查时间。在分枝杆菌培养方面，20世纪30年代1owenstein和JenSen研制了含孔雀绿的用于体外培养分枝杆菌的固体培养基。该方法一直沿用至今。1969年De1and和Wagner开发微生物半自动培养系统用于结核分枝杆菌复合群(MyCObaCteriUmtubercu1osiscomp1ex,MTBC)液体分离培养及药物敏感性试验。分枝杆菌培养逐渐发展为诊断结核病的金标准，其检测下限可达100条/m1活的结核分枝杆菌。2.结核病分子生物学诊断领域历史沿革：分子生物学技术的应用是结核病诊断的革命性进展。近20年来国际结核病实验室诊断技术进展主要是围绕着分子技术领域开展传统的基因扩增技术在20世纪90年代有所应用，但是因为污染造成的假阳性结果限制了其在临床的大范围推广。2003年环介导等温扩增技术(tubercu1osis-1oop-mediatedisotherma1amp1ificationzTB-1AMP)开创了半自动结核病分子生物学检测的先河，并于2016年获得WHO推荐用于结核病的筛查。2008年WHO推荐分子生物学检测平台线性探针技术用于MTBC菌种鉴定及利福平和异烟脱耐药性检测。但是上述平台需要手动操作并存在潜在的污染风险，限制了其在基层实验室的使用。2010年全自动Xpert®MTB/RIF平台上市用于MTBC和利福平耐药性检测，该系统是目前全球使用范围最广的结核病实验室诊断设备；2016年Xpert®MTB/RIF平台进行技术优化，敏感度进一步提升研发出Xpert®MTB/RIFU1tra平台用于MTBC和利福平耐药性检测，并于2017年获得WHO推荐。2023年WHO正式推荐印度TruenatTMMTB-RIF-Dx用于结核病及利福平耐药的快速诊断。综上,全球结核病实验室诊断的发展朝向自动化和高敏感度的方向不断前行。3.结核病抗原抗体诊断领域历史沿革：2011年WHO对全球市场上多个结核病血清学诊断试剂盒应用情况进行Meta分析，结果显示在肺结核患者中结核病血清学诊断试剂盒总体敏感度为0100%,特异度为31.0%100%，差异明显。因此,WHO限制其在结核病患者筛查中使用，特别是在结核病高流行国家。尽管WHo对于抗体诊断持否定态度，但基于尿液的抗原检测技术却成为结核病实验室诊断的潜在的重要方向。2011年基于尿液中MTBC脂阿拉伯甘露聚糖(IiPoarabinOmannan,1AM)抗原标志物研发的A1ereDetermineTMTB1AMAg试剂盒，通过在非洲多个国家的系统性评估，于2015年WHO推荐其用于TB/HIV双重感染者的结核病检查。抗原检测为结核病实验室即时检验(POint-Of-Caretesting,POCT)技术开辟了新方向。4.结核分枝杆菌感染检测领域历史沿革2023年全球结核分枝杆菌潜伏感染者占总人数的1/4,且其中5%10%可能发展为活动性结核病患者。1934年，F1orenceSeibert从旧结核菌素中提取了单一的蛋白沉淀物,并将其命名为纯蛋白衍生物(PUr而edproteinderivative,PPD),PPD经皮内注射后可引发迟发型变态反应(de1ayedtypehypersensitivityzDTH),后续用于检测机体是否接触过结核抗原。PPD为多种蛋白的混合物,之后早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白Io(CFP-IO)陆续被证实作为结核分枝杆菌感染后的主要特异性递呈抗原，可以激活记忆性淋巴细胞释放Y-干扰素，据此开发了多种感染检测试剂盒，以QuantiFERON(R)-TBGo1dInTUbe(QFT-Grr)和QuantiFERON(R)-TBGo1dP1US(QFT-POS)为代表。2018年WHO正式推荐QFT(S)-GIT和T-SPOT(S)JB试剂盒用于结核分枝杆菌潜伏感染筛查，这对使用免疫抑制剂前、老人或儿童等特殊人群的诊断意义重大。此外，2023年WHo推荐了包括印度血清研究所的Cy-Tb和俄罗斯Generium的Diaskintest®在内的基于结核特异性抗原的结核抗原皮肤试验(tubercu1osisantigen-basedskintests,TBST)用于结核感染的检测。5.耐药结核病诊断领域历史沿革：传统耐药检测是以观察结核分枝杆菌在含药培养基中的生长受抑制情况来区分敏感菌和耐药菌。传统表型方法以比例法、耐药比例法、绝对浓度法为代表，但这些方法耗时费力、操作复杂。BACTEC放射性方法和分枝杆菌生长指示管法(mycobacteriagrowthindicatortube,MG1T)等自动化方法进行药物敏感性检测，可以更加快速地检测药物的耐药性。2002年,美国食品药品监督管理局批准BACTECMGIT960用于结核分枝杆菌对链霉素、异烟明、利福平、乙胺丁醇和口比嗪酰胺的药物敏感性试验。BACTECMGIT960在阳性检出率和培养时间上具有明显的优势，缩短了报告时间，但是仍会延误结核病的治疗。近年来，根据耐药结核病的产生机制，涌现出一批基于耐药遗传性状的基因型检测方法。WHO推荐GeneXpertMTB/RIF或GeneXpertMTB/RIFU1tra作为结核病和利福平耐药的初始诊断检测方法，同时推荐了中等复杂程度自动化核酸扩增试验(moderatecomp1exityautomatedNAAT)用于诊断结核病，以及检测利福平、异烟船和其他二线抗结核药物的耐药性，特别是用于HIV阳性者。2023年，WHO共批准6项用于结核病诊断和抗结核药物耐药性检测的分子诊断技术，按照复杂程度分别为：低复杂程度自动化检测平台XPert®MTB/XDR;中等复杂程度自动化检测平台ReaITimeMTB和ReaITimeMTBRIFINHxMAXTMMDR-TB.cobas®MTB和cobas®MTB-RIF/INH、FIuroType（S）MTB和F1uroType®MTBDR高复徜呈度检测平台GenOSChOIarTMPZA-TBo目前，快速分子诊断技术的使用仍然不足，加速推广尤为重要。（二）国内结核病诊断技术的历史沿革依托于十一五"十二五和十三五传染病重大专项的支持，我国在结核病实验室诊断领域的研发和推广方面取得了积极的进展。结核病定点医院作为结核病诊疗的主要医疗机构而布局多种结核病的筛查技术，包括抗酸杆菌染色涂片、分枝杆菌培养、表型药物敏感检测、分子生物学、免疫学等一系列鉴别诊断和耐药检测工具，而非定点医院在通过痰涂片或分子生物学技术发现活动性结核病患者后，根据患者治疗需要将患者转诊至结核病定点医院。因此，非定点医院对高敏感度、快速筛查结核病等方面具有巨大的需求，以期发现更多的初筛结核病患者。近年来,在分子诊断领域，我国开发了多项具有独立知识产权的新诊断平台。1 .结核病鉴别诊断及耐药检测领域：（1）基于RNA的等温扩增技术：依托拥有独立自主知识产权的RNA恒温扩增实时检测技术(SimUItaneoUSamp1ificationandtesting,SAT)(2010年获得专利审批)的体外定性检测MTBC核酸试剂盒于2011年获得批准上市，因该试剂盒靶标为MTBC核糖体RNA(rRNA),不仅可用于肺结核的诊断，还可以用于抗结核治疗效果监测、肺外结核诊断等。Yan等前瞻性地对纳入的3608例疑似肺结核患者的痰标本使用SAT法进行检测，其中，2457例以通过微生物培养鉴定、肺部结核病灶病理学或临床诊