感染性疾病病原如何精准诊断.docx

感染性疾病病原如何精准诊断对每一位感染性疾病的患者来说，治疗尤为重要。而对于每一位临床医生来说，对感染的精准有效治疗，首要考虑的就是确定造成疾病的病原体。面对纷繁复杂、多种多样的检测手段，在精准医疗的时代，我们应该何去何从？病原诊断的金标准一培养？培养！1983年4月，研究人员从血液中分离出的第一株肺炎链球菌，为研究肺炎链球菌的世界分布做出了卓越的贡献。光阴荏苒，从1983年到现在，多种多样的方法：涂片镜检、抗原诊断、抗体、病理、分子生物学等方法，已经越来越多地走向临床，作为快速便捷的诊断方法被广为使用。对宿主反应模式的检测也成为我们的诊断感染病的方法之一。反观病原培养，阳性率较低，仅10旷30%；且需要较长的培养时间，如结核分枝杆菌需要长达45天。但即便如此，刘钢教授指出“无菌部位病原体培养，依然是诊断感染相关疾病的金标准。”不容忽视的新生力量一基因测序近几年，精准医学在病原诊断方面也势头渐起。从1995年完成第一株流感嗜血杆菌全基因组测序后，当代医学对病原的基因研究如雨后春笋般涌现，对病原基因的认识也有了突飞猛进的进展。随着对各个病原的全基因组序列了解广度的扩大，二代测序（NGS）已经能针对任一给定菌株，测定具体的序列，这些不同的独立基因，就是病原个性化的标志。反过来，根据对未知病原体的测序便能够推断并确定病原体。同时，二代测序还能够确定耐药基因，明确病原体的耐药特点，以及测定其他蛋白表达水平，为我们全面立体认识患者感染的病原体提供支持。目前已经广泛运用在MASA、结核等病原体中。1000-SOO-N8dJoON2010图1：1995-2010年针对基因组研究项目的数目临床棘手的结核，目前诊断方法上分为两大类:零a*学中y义克儿45优直接涂片1a<cMQT960快速液体培养系统2 .TKSIX-母核分枝杆菌快速培养系统3 .显微镜观察药物敏感性(MODS)质谱分析(MA1DI-TOFMS)1特异性Pa检测，如IPAZ全基因组测序发光二极管荧光显微镜检(1a)1.Y-干扰素释放试验(ICBA)2-DeterieTB-1AMAgIJCpertMTB/BForXpertMTB/BFU1tra之环介导等温扩增技术(3p)3.宏基因组检测图2：结核诊断技术2014年新英格兰杂志上发表的一篇报告则成了二代测序一个划时代的标志。让我们一起来看一看这个病例：一名14岁患有严重先天性免疫缺陷病的儿童，主要症状为反复发热头痛，患病4个月后出现昏迷。虽然医生考虑是神经系统感染，但利用了当时多达38项各种各样的检测方法，均未明确病原体。找不到病原，严重限制了医生的治疗选择。幸而，利用对脑脊液CSF的二代测序，终于有了突破性发现，测序结果发现了CSF中的钩端螺旋体序列。在这个基础上，医生有方向的通过血清学检测和特异性PCR检测，均证实了钩端螺旋体的感染。最后，这名儿童在运用青霉素治疗后很快好转，治疗有效！在这个案例中，二代测序为陷于诊断泥淖中的医生提供了一根绳索，帮助临床医生及时找到了病原体，在发生更严重的不可逆转的神经系统损伤前挽救了这名可怜的孩子。二代测序一不可不知的3件事1二代测序的特点与优点 通量极大 非靶向测序 不依赖于培养菌株 既可以发现已知病原体，又可以发现完全未知的病原体此外，二代测序的应用还有一些优点： 对病毒检测较为方便，尤其是HSV-1、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒等； 提高疑难感染性疾病病原诊断能力； 高效诊断：对于需借助特殊的染色或免疫学检查等方法的病原体，原本诊断需要等待时间较长，二代测序能快速鉴别诊断； 既可以发现已知病原体，又可以发现完全未知的病原体； 检测结果受抗生素影响很小； 与传统检测方法联用能有效提高病原检出效率； 在局灶感染中直接检测感染部位的标本更有显著优势。2 .二代测序检测价值有几何？mNGS和临床微生物检测（同次）在不同标本检测价值的比较图3：二代测序的检测价值对超过700例儿童进行测序，测序标本以CSF最多,其他还有血、脓液等其他组织标本。整体结果显示，二代测序检出阳性率，脓液标本达100%,而临床上针对脓液的传统检测阳性率不到50册所有标本总和计算，临床传统方法仅9.K阳性检出率，二代测序则能有效提高至26%o3 .结果影响因素有哪些?因素NGS阳性组(n=41)NGS阴性组(n=58)P年龄（天）230(69.5-425)116.5(65.5-392.5)0.379留取标本距离起病时间（天）15(8.5-28)31(17-45)0主诉时间（天）6(4-21)25(4-41)0.005确诊时间（天）4(2-8)3(1-6.75)0.660外周血WBC(×1091)173±11.913.5+7.30.074NE(%)66.7±15.754.7+20.20.002Hb(g1)104.0±19.9103.8±17.20.943CRP(mg1)29(11.0-101.1)27.7(8-108.5)0.393首次CSFWBC(×1061)910(336-2825)403(98-2040)0.125多核（%）70(38.75-85)60(22-75)0.165单核（%）24.3(15-55.5)38.5(23.0-75.0)0.099Pro(mg1)1278(837-2234)1340(596-1982)0.485G1u(mmo11)1.47(0.87-2.74)2.48(1.02-2.48)0.120NGS同次CSFWBC(×1061)10(2-17)11(2-37)0.432多核（%）10(4-16)12(5-20)0.723单核（%）20(12-28)30(15-54)0.051Pro(mg1)557(296-1149)594(367-1079)0.850G1u(mmo11)2.85(2.43-3.46)2.90(2.46-3.66)0.869Guo1Y.«a1JIfect201SDecI1piiSO163-U53（1S）3OJ5'-S图4：二代测序的影响因素在众多可能影响因素中，对临床工作最具有指导意义的，即尽可能缩短患者出现主诉后的时间，和留取标本距发病的时间，这样能最有效的提高测序所能测得的序列数，增加检出可能。简单来讲就是，早发现，早取样，二代测序不用怕。二代测序未来之路虽然二代测序在辅助进行病原诊断上具有很大的贡献，尤其是疑难、少见病原体。但是临床上仅仅二代测序的结果阳性，其他传统方法阴性的现象并不少见。对于这种情况，是继续坚持传统方法检测直至阳性用药，还是基于二代测序结果尝试性用药？目前仍主要依赖于临床医生的个人判断。所以，临床亟需一个统一的标准来评价二代测序的结果可信性。目前采用二代测序的结果尚需要慎重判断。但是无论如何，基因诊断、精准医学的时代已经到了。手握一个未知菌株，便能很快通过二代测序确定具体菌株，掌握耐药特点和菌株毒力，还能预测抗生素的敏感性一一这将是最好的时代！新的诊断技术已经来到身边，为了避免滥用，刘钢教授提出将重视临床诊疗规范和重视新技术应用规范与评价相结合，利用二代测序新技术助力病原精准诊断。