鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析.docx

摘要：为进一步研究鲤疱疹病毒型(CyPrinidherpesvirus2,CyHV-2)0RF4蛋白的功能，通过PCR扩增CyHV-2W4基因，并构建重组穿梭质粒PFaStBaCHTA-OR理,将其转化至大肠杆菌DH1oBaC感受态细胞后获得重组杆粒BaCmid-0网；采用脂质体法转染Sf9细胞后，利用间接免疫荧光法QFA)和Westernb1ot鉴定重组蛋白，采用His亲和层析柱纯化重组蛋白，并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明：转染72h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化；间接免疫荧光结果显示，重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光；Westernb1ot结果显示，纯化的CyHV-2ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应；小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-20RF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明，本研究中获得的CyHV-2ORF4蛋白有较好的免疫原性，为CyHV-2ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。关键词：鲤疱疹病毒型(CyHV-2)；杆状病毒表达；ORF4蛋白；免疫原性鲤疱疹病毒型(CyPrinidherpesvirus2,CyHV-2)是引起鲫造血器官坏死症的病原，具有较强的致病性。流行病学表明，CyHV-2感染后会引发鲫出现体表、鳏出血，内脏肿大出血，鳗、下颌多处充血，眼球突出，眼球基部充血等症状，对1龄幼鱼具有强烈的致病性，严重威胁中国鲫养殖业的健康发展。然而，迄今尚缺少有效控制该病暴发的措施，对其发病机制也缺乏了解。为逃避宿主的免疫攻击，病毒在长期进化过程中，发展出多种免疫逃逸策略阻断宿主免疫应答。其中，疱疹病毒等大分子DNA病毒，能通过编码一些宿主细胞免疫调节蛋白类似物(如干扰素受体类似物、白介素类似物、肿瘤坏死因子受体类似物等)干扰宿主的免疫应答，从而逃逸宿主的免疫清除，这一类病毒编码蛋白也被称为病毒编码受体(Viroceptor),其作用主要是阻断和抑制细胞因子与其受体结合，从而抑制宿主细胞的免疫反应。研究发现，一些DNA病毒可编码TNFR类似物(VTNFR)进而参与病毒的复制过程，目前，兔纤维瘤病毒(ShOPefibromavirus,SFV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SingaPOregrouperiridovirus,SGIV)和鲤疱疹病毒I型(CyPrinidherpesvirus3,CyHV-3)等均有相关报道。CyHV-2病毒隶属于疱疹病毒目Herpesvira1es鱼疱疹病毒科A1IOherPeSViridae鲤疱疹病毒属GTZrMras。该病毒最早于1992年在患病金鱼上发现，由于其是从鲤科鱼类分离的第二种疱疹病毒，故被命名为鲤疱疹病毒型。在结构方面，CyHV-2病毒具有鱼类疱疹病毒的一般特征，病毒是一种较大的线性、双链DNA病毒，具有二十面体立体对称的衣壳结构，衣壳外为皮质层和囊膜。目前，CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，病毒基因组全长为290304bp,共编码约154个潜在开放阅读框。在CyHV-2基因组中，开放阅读框4(openreadingframe4,0RF4)位于CyHV-2的反义链上,位置在0RF150-0RF151,其编码一种具有TNFR结构域的非结构蛋白。有研究报道，此类蛋白可能在CyHV-2的免疫逃避中发挥作用，但其具体功能尚未见报道。本研究中，利用杆状病毒表达系统表达纯化CyHV-2ORF4重组蛋白，并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性，以期为进一步研究CyHV-2ORF4蛋白的功能提供参考。1材料与方法1.1 材料BA1B/c小鼠（生产许可证号：（辽）2013-0003）购自大连医科大学SPF动物实验中心。PFastBacHTA质粒、大肠杆菌DH1oBaC感受态细胞、Sf9细胞（草地贪夜蛾细胞）、CyHV-2病毒由盐城工学院水生动物免疫与疾病研究所保存。EXTaq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶等购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌DH5Q感受态细胞购自生工生物工程（上海）股份有限公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；鼠抗6XHistag单抗购自武汉博士德生物工程有限公司；AP标记的羊抗鼠IgG.FITC标记的羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术公司；锲离子琼脂糖凝胶6FF预装柱购自赛尔瑞成（北京）生命科学技术有限公司；Ce11fectinn,转染试剂购自InVitrOger1公司。1.2 方法1.2.1CyHV-2ORF4基因的扩增参考GenBank数据库中CyHV-2W4基因序列（GeneID:14011391）,设计引物扩增CyHV-2ORF4的编码序列。其上游引物6½7¾-F：5'Ggaattcgccaccatgacacctccaccaacaacac3'；下游引物WVR：5'Cgggtcgacaagctcttctgatgga-gtgggtgc3,(下划线处分别为酶切位点EcoRI和/Do引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以CyHV-2感染异育银鲫的脾脏DNA为模板,用PCR法扩增CyHV-20RF4基因片段。PCR反应条件为：95C下预变性5min；95°C下循环变性1min,60C下退火复性1min,72C下延伸1min,共进行32个循环；最后在72下再延伸10mino将扩增产物用10g/1琼脂糖凝胶电泳进行分析。1.2.2重组穿梭载体的构建将ORg扩增产物克隆至pMD19-T载体上，挑取阳性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司使用通用引物(RV-M：5'Gagcggataacaatttcacacagg3,；M13-47：5'Cgccagggttttcccagtcacgac3z)进行测序。选取测序正确的阳性菌株，大量培养后进行质粒小提，用限制性内切酶EcoRI和Sa1I分别将PMDI9-T-W4和PFaStBaCHTA载体进行双酶切，用T4DNA1igaSe进行连接后转化到大肠杆菌DH5感受态细胞中，采用菌液PCR和测序鉴定后，获得重组穿梭载体PFaStBaCHTA-W4。将重组转移质粒转化至大肠杆菌DH1OBaC感受态细胞，涂布于含有四环素(IOnIg/1)、硫酸卡那霉素(50mg1).庆大霉素(7mg/1)、IPTG/X-ga1的蓝白斑筛选平板上，37下倒置培养48ho挑取白色菌落加入SoC培养基中，振荡培养约3h,按照通用引物(M13-F：5'Cccagtcacgacgttgtaaaacg3'；M13-R：5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG3')进行菌液PCR鉴定，将阳性菌株进行重组杆粒DNA的提取，并命名为BaenIid-a网，4°C下保存备用。1.2.3 重组杆状病毒的获得与鉴定按照IX1o个/孔的细胞数，将生长旺盛的Sf9细胞加入6孔细胞培养板中进行培养。将上述阳性重组杆粒Bacmid-f1A7¾,采用CenfeCtiIrII转染试剂转染对数生长期的Sf9细胞，28C下恒温培养，观察细胞病变，35d后细胞出现病变，收集细胞培养上清液，为第一代重组杆状病毒；用得到的P1代病毒继续感染Sf9细胞，28°C下恒温培养，获得P2代病毒；用P2代病毒继续感染Sf9细胞，28°C下恒温培养，获得P3代病毒。将P3代重组杆状病毒接种Sf9细胞72h后（同时设置空白细胞对照），采用间接免疫荧光法（IFA）对重组杆状病毒进行鉴定。具体方法为:待转染的Sf9细胞出现病变后，吸弃上清液并加入适量体积分数4%的多聚甲醛。用含3%（质量分数）牛血清蛋白（BSA）的PBS于37C下封闭1h,加入鼠抗6XHistag单抗（1：500稀释）为一抗，37下孵育1h,用PBS洗涤；以FrrC标记的羊抗鼠IgG抗体（1：800稀释）为二抗,37下孵育1h,用PBS洗涤。用含抗荧光衰减淬灭剂的封片剂进行封片，在倒置荧光显微镜（江南XD-202）下观察分析。1.2.4 重组CyHV-2ORF4蛋白的纯化取P3代重组杆状病毒感染72h后的Sf9细胞，用预冷PBS洗涤，加裂解缓冲液（50mmo1/1Tris、500mmo1/1NaCK5%甘油、10mmo1/1咪嚏，pH7.5）重悬，用超声波破碎细胞（超声10s,停10s,共进行10个循环），4下以12000r/min离心30min,取细胞裂解上清液进行SDS-PAGE电泳，设置未转染杆状病毒感染Sf9细胞为阴性对照。收集病毒感染的Sf9细胞裂解上清液，使用琼脂糖凝胶6FF预装柱，依照说明书进行蛋白纯化。采用BCA法测定蛋白浓度，-80下保存备用。1.2.5 Westernb1ot分析将纯化产物转移到PvDF膜上,用含3%BSA的PBS于4下封闭过夜，用鼠抗6XHistag单抗（1：2000稀释）作为一抗，37C下孵育Ih,用PBST洗涤3次，每次5min；使用AP标记的羊抗鼠IgG（I：3Ooo稀释）作为二抗，37下孵育1h,用PBST洗涤3次，每次5mino最后使用BCIP/NBT显色试剂盒于暗处显色20min,观察有无棕色条带出现。1.2.6 重组CyHV-2ORF4蛋白的免疫原性分析将6只BA1B/c小鼠分为两组，每组3只。对照组和试验组均在第0、7、14、21和28天时通过尾尖采血制备血清，于-80C下保存备用。在对小鼠取血清结束后，试验组随即对每只小鼠注射重组0RF4蛋白进行免疫，对照组随即对每只小鼠注射PBS缓冲液。免疫过程具体为：将纯化的重组CyHV-20RF4蛋白溶液与弗氏佐剂混合（体积比为1：1）后乳化，分别在第0、7、14、21天时以腹腔注射的方式免疫3只BA1B/c小鼠，每只注射100Rg的ORF4蛋白（体积100U1）,对照组每只小鼠注射100R1PBS缓冲液。以每孔1Ug重组ORF4蛋白包被酶标板，使用间接E1ISA方法检测免疫小鼠诱导产生特异性抗体的效价。以制备的免疫血清作为一抗（100口17孔，1：100稀释于PBS缓冲液中），以AP标记的羊抗鼠IgG（1：3000稀释于PBS缓冲液中）作为二抗，加入pNpp-Na发色液后，用酶标仪测定405nm波长下的吸光值。2结果与分析2.1CyHV-2ORF基因的扩增采用PCR法对CyHV-2W4基因进行扩增,琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物在约1OOObp处出现了一条特异性条带（图1A）,进一步将其克隆入pMD19-T载体上，经EcoRX和Sa1I双酶切后，得到了大小约1000bp左右的条带（图1B）,这与W4基因的片段（GeneID：140111391）大小相符。测序结果也表明，扩增片段与CyHV-2。帆基因序列的一致性为100%oM1D12000DNAMarker；M2D15000DNMarker；1PCR扩增产物；2重组克隆质粒PMD19-T-0的的双酶切鉴定。M1D12000DNAMarker；M2D15000DNAMarker；1productofPCRamp1ification；2-doub1eenzymedigestionofrecombinantc1oningp1asmidpMD19-T-,M.图1CyHV-20RF4基因的扩增及pMD19-T-m的双酶切鉴定Fig.1Amp1ificationofCyHV-2ORF4anddoub1eenzymedigestionofpMD19-T-0RF42.2重组穿梭载体的构建与鉴定分别用M13F、M13R引物对重组杆粒BaCmid-刎进行PCR鉴定。从图2可见，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后，在约3500bp处可见特异性条带，与预期片段大小相符，表明6基因转座成功。MD110000DNAMarker：1recombiantBacmidDNA.图2重组杆粒DNA的鉴定Fig.2IdentificationofrecombinantBacmidDNA2.3重