指南诺如病毒的实验室检测.docx
诺如病毒的实验室检测（一）标本采集多种病原体可引起急性胃肠炎聚集性或暴发疫情，应充分考虑不 同病原体检测对标本采集和保存的特殊要求。因此对同一采集对象, 应按照细菌、病毒、寄生虫等不同要求，采集、分装和保存多份标本， 以备必要时做其他病原体检测、复核实验结果或进一步鉴定。采样时 需填写标本信息登记表（见附件4）。1 .标本类型粪便诺如病毒检测首选粪便标本。每份标本5g或5ml以上，直接放 置于清洁、无菌、干燥的密闭容器内。容器内不可加入任何保护剂、 培养基、去污剂或金属离子，不可稀释。肛拭子肛拭子标本不能长期保存，且检出率低于粪便标本。肛拭子含粪 便量很低时，如检测结果呈弱阳性，结果容易被误判，导致假阴性。 采集时需注意肛拭子上应有可见的粪便，放入无菌带盖密闭采样管。 采样管中应有2ml无菌PBS缓冲液或Hank,s液，液体需没过肛拭子 棉签部分，并尽快检验。呕吐物呕吐物每份标本采集5g或5ml以上，直接放置于清洁、无菌、 干燥的密闭容器内。容器内不可加入任何保护剂、培养基、去污剂或 金属离子，不可稀释。水目前没有水样品采集量的权威规定。怀疑水源性暴发时，建议尽 量采集1升以上的水样品。桶装水、瓶装水等直接采集原包装，自来 水需要以无菌容器采集。采用膜过滤法浓缩后检验，有助于提高检出 率。食品由于食品成分复杂、病毒含量不高，从食品样品中提取诺如病毒 RNA的回收率受限。本指南仅提供海产品、草莓、蓝莓和部分蔬菜的 参考方法。推荐采集牡蛎、海虹至少10个，三文鱼200克，扇贝、 毛蛤、文蛤等250克，草莓、蓝莓250克，生菜和芽苗菜等500克。 食品样品应置于无菌容器中，立即4。C冷藏，当天运至实验室进行检 验。环境涂抹样根据疫情调查需要采集疫情发生机构相关场所如厨房、厕所、门 把手、玩具等环境涂抹样品。可用无菌拭子在无菌PBS里蘸湿，用力 涂抹待采表面（最大面积IOOcm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解 缓冲液中（QlAamP试剂盒560ul, Genaid试剂盒400ul）°2 .标本采集对象病例采集病例发病25天内的粪便、带便肛拭子或呕吐物标本。若病 例在10例以下，全部采集；病例在10例以上，至少采集10例病例 的标本。根据初步流行病学调查结果，尽量采集重点病例（如首发病 例、指示病例、住院病例、发病的食品从业人员、重点岗位的病例等） 的标本。重点人群根据疫情调查需要，可采集食品从业人员、护理员等工作人员的 粪便、带便肛拭子标本。重点采集近期出现过胃肠不适症状、直接接 触食品的食品从业人员、直接接触早期病例的护理人员等。3 .标本保存和运输标本在4冰箱可暂存12小时，之后标本应放置20以下冷冻 保存，需长期保存的标本应储存在-70冰箱，避免反复冻融。依据 人间传染的病原微生物名录，含诺如病毒的标本属于B类包装分 类，需按照UN3373规定进行包装和手续申报，并在冷藏或冷冻条件 下运送。通常对于短途运输（1天以内），包装盒内放冰袋或冰排, 长途运输（1-2天）需用干冰。但无论短途或长途运输，均需保证冻 存标本在运输过程没有出现融化。标本送达实验室时应包装完整，包 装盒内应有未融化的冰。在运输中应避免强烈震动、重力挤压等现象。 标本保存和运送的条件应有详细记录。（二）标本检测为避免实验室污染，食品、水、环境样品与病人标本不能在同一实验室检测，必须分别在独立的空间进行样品处理和检验。1 .核酸检测和基因型鉴定完整的检测流程应包括以下6个步骤，见图1。传统RTpcR检测漏序Jt因分型图1诺如病毒核酸检测和基因型鉴定流程图(l)Real-time RT-PCRORF1/ORF2区是诺如病毒基因组中最保守的区域，在同一基因 型不同毒株间有相同的保守序列，根据这段保守区域可用于设计 TaqMan为基础的Real-time RT-PCR的引物和探针。除可检测病例临 床标本中的诺如病毒RNA外，引物和探针经优化提高灵敏度后，还 可用于环境样本(如食物和水)的检测。ReaI-timeRT-PCR的敏感性 高于传统RT-PCR,可检测诺如病毒Gl群和Gn群。传统RT-PCR采用传统RT-PCR对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因型。测定0RF2完整衣壳 蛋白基因序列，是诺如病毒基因分型的金标准。基因组中四种不同的 区域（RegionA-D）均可用于诺如病毒基因分型，基于衣壳蛋白区 RegionC和D两区域分型效果更好。但对于GII.4变异株的进一步分 型，仅根据RegionC序列不足以区别，需进一步扩增RegiOn D。2 .抗原检测由于诺如病毒抗原高度变异（基因型超过29个）且某些基因型 存在抗原漂移（如GII.4型），开发广泛反应的ELISA方法存在较大 挑战。虽然目前已有商品化的试剂盒如IDEIA （OXiOd,英国）、 SRSV（II）-AD （DenkaSeiken,日本）以及 RIDASCREEN Cr-Biopharm AG,德国），但其敏感性（36%80%）和特异性（47%100%）均不 太理想。即使已通过美国FDA认证的Ridascreen诺如病毒第三 代ELISA试剂盒，也没有在美国广泛应用。ELISA可适用于暴发疫 情中大量样本的筛查，但不适合散发病例的检测。ELISA检测结果阴 性的样本还需要通过Real-time RT-PCR进行第二次检验确认。鉴于 ELISA试剂盒成本高、敏感性低，ELISA方法仅可作为辅助检测手 段。标本处理、核酸提取和检测、测序和基因定型，抗原检测的操作 方法和要求见附件5。附件4-1病例或重点人群标本采集登记一览表标本编号姓名性别年龄发病日期采样日期标本类型备注标本编号暴发编号采样日期采样数量标本类型备注附件5诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、 Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步 骤。ReaI-timeRT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金 标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物 进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚 集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。 食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。1标本前处理1.1 粪便、呕吐物1.1.1 设备和材料微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml无 菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS） IOmM pH7.0-7.4o1.1.2 操作方法（1）离心管每管分装0.5mlPBS0用一次性移液管（或无菌棒）添 加豌豆大小的粪便（约0.1克），稀释成约10%至20% （重量/体积） 的粪便悬浮液°当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用 500ul的样品。（2）漩涡振荡每个样品1分钟。在500OrPm下离心5分钟，使 得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于7（rc。（3）取澄清的上清液200Ul进行RNA提取。1.2 水通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏(1.5%wv)含0.05M甘 氨酸(pH9.0)缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep IOOTM或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。1.2.1 设备和材料DEPC水、新配置次氯酸盐(至少1%)或等效消毒剂、Millipore HAfnter (孔径0.45um、)、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度 计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱(2(rC、-700、Microsep IOO K columns (PALL 公司)、Centriprep YM-50 (MiniPore 公司)、洗脱液 (BE-0.05GlyPH7.0)、PBS(PH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。1.2.2 操作方法1.2.2.1 过滤装置准备(1)使用无菌的镜子将滤膜放在滤器架上，滤膜有三层，型号分 别为 MilliporeHAfilter. APl5 和 AP20,放置顺序为 MilliporeHAfilter f AP15 AP20o注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的 那边向下。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。(2)将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。(3)使用不锈钢滤器夹进行水的密封。(4)真空泵连接IOOOml的锥形瓶。注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安 全柜进行操作Q(5)向滤器中倒入20ml无菌水(DEPC水)检查滤膜的密封情况。(6)打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。1.2.2.2 水样品的过滤(1)向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。(2)用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。1.2.2.3 用酸漂洗滤膜将膜用无菌的镶子夹放在有200ml 0.05mM H2SO4 (pH3.0)的无 菌500ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+o1.2.2.4 洗脱(1)将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml洗脱液。盖 上铝箔。注意：要将滤膜的上边向下(倒置)放在锥形瓶里。(2)将锥形瓶放在恒温摇床上，转速45rpm,室温(23± 3), 15mino(3)关闭摇床，将洗脱液(大约5ml)转移到管子里。1.2.2.5 中和洗脱液用INHCI或INNaOH调整洗脱液的PH到7.0-7.4。检测前，洗 脱液在70。C储藏。1.2.2.6 二次浓缩方法一：用 Microsep IOO K columns 或 Centriprep YM-50 浓缩病(1)为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。(2)将水标本滤膜洗脱液(大约5ml)加入到浓缩柱中，5000rpm离心5mio(3)吸取浓缩液(约150l),转移至1.5ml离心管中。方法二：PEG沉淀(1)向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3molL (若洗脱液为 5ml加0.08775g的NaCl),有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000 终浓度为12.5% (wv)(若洗脱液为5mL加0.0625g的PEG-6000。 4过夜。(2) 4, IOoOOrPm离心30分钟，收集沉淀。(3)MiniPOreHAfnter,倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150- 500l pH7.2(±0.2)PBS重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上， 为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。室温 放置30mino注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。 吹打过力会产生气泡。(4)向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇(1:1 vol/vol)混合。去除 病毒悬液中的抑制剂。(5) 4, IOOOOrpm,离心 20 分钟。(6)分离出水相(
