HBVDNA核酸扩增.docx

HBV-DNA核酸扩增标准操作规程1 .目的规范HBV-DNA定量的PCR样本制备操作，减少实验误差。2 .范围HBV-DNA定量检测实验的核酸扩增操作。3 .操作人员PCR室在岗工作人员。4 .操作步骤5 .1PCR扩增4.1.1PCR扩增前准备：先打开电脑，将Mx3000P后方电源开关打开。4.1.2打开电脑上的Mx3000P软件，在PEteSetUP里,选择需要的样本孔，在WeI1type中设定Standard（标准品）、NTC（阴性对照）、NPC（阳性对照）、unkown（样品）；双击所选孔，自动跳出WeI1Information®,EName框中输入样本号，在COn1mentS框中输入HBV,点击ShoWWeHNameS就能显示样品编号，编号结束选中样本孔，使之呈现浅蓝色，选择荧光通道FAM和HEX,对于标准品，在We11type中设定为“Standard”后，点击标准品的各个孔位，在SIandardquantity:IFAM一三4e+0007栏，手工输入浓度O4.1.3打开扩增程序：点击ThermQIProfi"Sotup,点击Import,点击我的电脑，打开D盘，双击date,选择最近所做的同批号试剂的文件，打开，核对扩增程序。4.1.3.1HBV扩增程序为Stage1：37,2min；Stage2：94,2min；Stage3：94,15sec55°C,45sec,45循环荧光信号收集时设定为55C,FAM荧光素。反应体系为50U14.1.4文件保存：点击界面左上角保存按钮，文件保存在D:dateHBV中，文件名：HBV+当天日期。4.1.5把待测PCR反应管按照样本孔编号位置放入加热模块，核对无误后再将热盖盖紧，拉下PCR仪前方的盖子。4.1.6点击软件界面右上方的点击Start开始实验。勾选“Turn1ampoffatendofrun"，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤鸨灯。4.2结果分析4.2.1PCR运行结束后，点击.前断馆,再点击ReSUIts,软件将自动进行结果分析。4.2.2在没有带标准曲线的情况下可引入同批号试剂最近所做的标准曲线来分析本次实验结果，带标准曲线的直接分析。4.2.3阈值:阈值暂时定为1500-3000。4.2.4室内质量控制4.2.4.1阴性质控：HBV-FAMet值为NOCt,内标(HEX)Ct值45,且有较好的对数增长曲线。4.2.4.2阳性质控：阳性质控品在控，有较好的对数增长曲线。4.2.4.3定量标准品：全为阳性结果，且标准曲线相关系数在0.98以上。(以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。)4 .2.5本试剂盒最低检测下限为：15IUm1;线性范围为：5.00E+002IUm1-2.00E+009IUm15 .附表PCR室流程记录表