南极磷虾羧甲基壳聚糖(CMC)的微波辅助法制备及其性能.docx

摘要:为研究一种快速高效制备竣甲基壳聚糖(CMC)的方法，以南极磷虾EuphausiaSSe2也?虾壳为原料，采用微波辅助法制备CMC,通过微波功率、微波时间、质量分数40%的NaOH溶液用量、体积分数50%的氯乙酸-异丙醇溶液用量等4个因素的单因素试验和正交试验，以CMC取代度作为评价指标确定最佳工艺参数，对所得产物进行结构表征，并测定CMC的水溶性和抗氧化性能。结果表明：优化得出的最佳制备工艺为微波功率540W、微波时间30min、40%NaOH溶液总用量100m1、50%氯乙酸-异丙醇溶液用量为40m1,在此条件下，CMC取代度为0.95；结构表征分析显示，所制备产物为N,0-CMC；CMC在PH为412时均具有良好的水溶性，且羟基清除能力和总抗氧化能力均优于壳聚糖(CS)。研究表明，采用微波辅助法能够显著提高南极磷虾CMC的制备效率，所得CMC具备良好的水溶性和抗氧化性，该研究结果为CMC作为水溶性抗氧化剂的应用提供了理论基础。关键词：南极磷虾；虾壳；壳聚糖(CS)；竣甲基壳聚糖(CMC)；微波辅助法；抗氧化性南极磷虾Euphausiasuperba作为一种丰富的海洋生物资源，壳体中含有大量的甲壳素。壳聚糖(ChitOSan,CS)是甲壳素脱乙酰化后的产物，是天然存在的唯一碱性多糖。目前，商品化CS的来源主要是虾蟹壳。南极磷虾壳薄柔软，处理方便，相比从其他虾类中提取甲壳素所需的时间更短，效率更高。因此，南极磷虾壳可以作为CS制备的有效来源。由于CS在中性PH条件下基本不溶于水，限制了其应用，因此，水溶性CS成为国内外学者的研究热点。孟祥君以CS为原料，氯乙酸为竣甲基试剂，油酸为酰化试剂，制备出竣甲基油酸壳聚糖，两者在PH中性及碱性条件下都是可溶的。Wang等也制备出了比CS具有更好水溶性的O-季镂化壳聚糖。段甲基壳聚糖(CarbOXymethyIchitosan,CMC)是CS酸化改性后的重要产品之一，具有比CS更好的生物活性(抗氧化性等)和性能(阻氧、保湿、透气和成膜性等)。目前，国内外对CMC的研究非常广泛。郭睿等以CS和氯乙酸为原料，合成了CMC,但所需制备时间为7h,耗时较长。郑丝柳等利用废弃淡水龙虾壳，采用两步加碱法制备CMC,以二甲亚飒代替异丙醇作为反应溶剂，虽然产物取代度有所提高，但是耗时较长，操作繁琐。MUZZareI1i等以乙醛酸为竣甲基化试剂制得了N-CMC,但乙醛酸成本较高，且其后处理条件苛刻。CMC制备的方法较多，但是存在制备时间长、操作繁琐等缺点。利用微波辅助法制备CS衍生物近年来备受学者关注，与常规加热相比，该方法不仅可以将反应速率提高几个数量级，而且可以显著减少所需的试剂量，从而减少产生的废液量。1iu等用微波辅助法在水溶液中制备了季铁盐CMC,其竣甲基基团和季镂盐基因分别为0.82和0.48,合成过程减少了有机溶剂的使用，表明微波辅助法是一种快速合成水溶性CS衍生物的方法。本研究中，以南极磷虾虾壳作为试验原料，采用微波辅助法代替传统水浴加热方法制备CMC,并通过单因素和正交试验对竣甲基化过程进行工艺优化，分析反应过程中各因素对产物取代度的了结构表征分析，并对其水溶性和抗氧化能力进行比较，以期为进一步研究南极磷虾CMC的应用提供理论基础。1材料与方法1.1 材料原料：试验用冷冻南极磷虾购自辽宁省大连海洋渔业集团公司，贮存在超低温冰箱（-80）中。试剂：NaOH、盐酸、异丙醇、无水乙醇、甲醇、硫酸亚铁、水杨酸、氯乙酸、30%过氧化氢、1,1-二苯基-2-三硝基苯脱（DPPH）均为分析纯;总抗氧化能力检查试剂盒（FRAP法）为上海碧云天生物技术有限公司产品O仪器：MM721NG1-P1150美的微波炉（中国美的集团）、H2050R台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、JB-IA型磁力搅拌器（上海精密科学仪器有限公司）、双列四孔恒温水浴锅（上海慧泰仪器制造有限公司）、PH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、DZF-6050型真空干燥箱（上海慧泰仪器制造有限公司）、Nico1et6700傅立叶红外光谱仪和HitachiS-3400N扫描电子显微镜。1.2 方法1.2. 1壳聚糖的制备甲壳素提取：将贮存在-80C冰箱内的南极磷虾流水解冻，通过碾压法人工剔除虾肉，将虾壳于60下烘干，用豆浆机粉碎2min,得到虾壳粉。称取10.OOg南极磷虾虾壳粉，加入100m15%HCI溶液（均为体积分数，下同），在室温下反应Ih后用蒸储水洗涤至中性。然后加入100m14%NaOH溶液（均为质量分数，下同），在100C下反应1h后用蒸储水洗涤至中性。将得到的甲壳素于60°C下烘干。CS制备：称取5.0Og甲壳素于用堪中，加入50m1的45%NaOH溶液，放置在电加热板上加热，加热温度为110,时间为3h。反应完毕后将所得CS用蒸储水洗涤至中性，于60°C下真空干燥烘干。采用乌氏黏度计法测定CS分子量，采用酸碱滴定法测定脱乙酰度。得到的CS黏均相对分子质量约为363200,脱乙酰度为90%以上。1.2.2微波辅助法制备竣甲基壳聚糖的单因素试验CMC的制备过程：采用两步加碱法制备CMC。称取5.00gCS后加入60n1异丙醇，在室温下溶胀1h后加入一定量的40%NaOH溶液于30C下搅拌1h,然后再加入一定量的50%氯乙酸-异丙醇溶液（均为体积分数，下同），设定一定的微波功率和微波时间，待微波加热后再次加入相同量的40%NaOH溶液，在50C条件下反应Ih后，用盐酸溶液调节PH至7.0,以IOOOOrmin离心5min,取上清液后用无水乙醇使CMC沉淀析出，然后用甲醇多次洗涤后于60C下真空干燥，即得南极磷虾CMC。微波功率和微波时间单因素试验：以5.0OgCS为原料，在微波功率540W、微波时间20min、40%NaoH溶液总用量87.5m1（每次加入43.25m1）,50%氯乙酸-异丙醇溶液用量40m1条件下，固定其中3个因素，分别进行不同微波功率、微波时间对所制备的南极磷虾CMC取代度的影响试验，其中，微波功率设置为120、230、385、540、700W,微波时间设置为10、15、20、25、30minoNaOH溶液、氯乙酸-异丙醇溶液用量单因素试验：以5.00gCS为原料，在微波功率540W、微波时间25min、40%NaOH溶液总用量100.0m1(每次加入50.0m1).50%氯乙酸-异丙醇溶液用量40m1条件下，固定其中3个因素，分别进行不同40%NaOH溶液用量、50%氯乙酸-异丙醇溶液用量对所制备的南极磷虾CMC取代度的影响试验,其中,40%NaOH溶液总用量设置为62.5、75.0、87.5.100.0.112.5m1(分两次加入),50%氯乙酸-异丙醇溶液用量设置为20、30、40、50、60m1o1.2.3制备CMC的正交试验根据单因素试验结果，采用4因素3水平正交试验。以正交试验优化后的最佳微波辅助工艺条件制备CMC进行验证试验，并以传统水浴加热辅助工艺(60、3h)作为对照。1.2.4CMC取代度(DS)的测定采用电位滴定法进行测定,即用0.1mo1/1HC1标准溶液溶解CMC,配制成质量分数为设的CMC-HC1溶液，再用0.1mo1/1NaoH标准溶液进行滴定，在滴定的同时测定溶液pH,根据下式计算CMC取代度：A=(K-K)cinf(1)DS=O.2034/(1-0.0580)。其中：勿为样品质量(g);。为NaOH标准溶液浓度(mo1/1)；/、K分别为PH为2.1和4.3时滴定所消耗的NaOH标准溶液的体积(m1)；A为样品中竣甲基物质的量(mmo1/g);每个乙酰氨基葡萄糖残基的物质的量为0.203mmo1,每毫克当量的竣甲基质量为0.058go1.2.5 南极磷虾CMC结构表征分析1)傅立叶红外光谱的测定。采用KBr压片法，对CS和CMC进行测定。将KBr与样品按1：100进行混合并研磨均匀，光谱扫描在波数4000400内，分辨率为4cm1,扫描32次。2)扫描电镜观察。采用扫描电子显微镜观察CS和CMC的表面结构。将样品放入真空干燥箱烘干(105,8h)后喷金，低真空模式下分别在100倍、1000倍和2OOO倍的全景下观察。1.2.6 南极磷虾CMe性能分析1)水溶性能测定。用0.1mo1/1的HC1和NaOH溶液调整水溶液PH为3-12,将样品溶解在不同PH的水溶液中制成5mg/m1的样品。用紫外可见分光光度计测定溶液在600nm处的透射率。对于每个测试样品，构建透射率随PH的变化曲线。以蒸储水的透射率为对照，当透射率小于90%时，认为样品是不溶的。2)抗氧化能力测定。清除1,1-二苯基-2-三硝基苯脱(DPPH)自由基的测定：参考Brand-Wi11iams等的方法测定南极磷虾CS和CMC清除DPPH自由基的能力。清除羟基(0H)自由基能力的测定：通过FentOn反应，测定南极磷虾CS和CMC清除羟基自由基的能力。具体步骤参考刘红莉的方法。总抗氧化能力的测定：采用总抗氧化能力试剂盒(FRAP法)测定南极磷虾CS和CMC的总抗氧化能力。1.3数据处理每个试验重复3次,试验数据以平均值土标准差(mean±S.D.)表示。采用Exce12010软件处理数据，采用SPSS23软件对数据进行单因素方差分析(OnerayANoVA),采用DUnCan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05o2结果与分析2.1 微波辅助制备南极磷虾CMC工艺优化试验单因素试验结果从图1(a)可见：随着微波功率的增加，CMC的取代度随之上升；当微波功率为700W时，CMC的取代度达到最大，为0.80,而微波功率为540W时CMC取代度为0.79,且与微波功率为700W时CMC取代度变化无显著性差异(>0.05)o故本试验条件下，微波功率为540W时较佳。标有不同字母者表示组间有显著性差异(K0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(>0.05)oThemeanswithdifferent1ettersaresignificant1ydifferentinthegroupsatthe0.05probabi1ity1eve1,andthemeanswiththesame1etterarenotsignificantdifferences.图1CMC单因素试验结果Fig.1Sing1efactortestresu1tsofCMC从图1(b)可见：CMC的取代度随着微波时间的增加呈先升高后下降趋势(W0.05)；当微波时间为25min时CMC取代度最大(0.78)。故本试验条件下，微波时间为25min时最佳。从图I(C)可见：随着40%NaOH溶液总用量的增加，CMC的取代度呈先上升后下降的趋势；当40%NaOH溶液总用量为100矶时，CMC的取代度最高(O.77)。故本试验条件下，40%NaOH溶液总用量为IOOn11时最佳。从图1(d)可见：随着50%氯乙酸-异丙醇溶液用量的增加，CMC的取代度呈先升高后下降的趋势；当50%氯乙酸-异丙醇溶液用量为50m1时，CMC取代度达到最大(0.84),且与50%氯乙酸-异丙醇溶液用量为40m1的CMC取代度(0.79)无显著性变化(00.05)。故本试验条件下，50%氯乙酸-异丙醇溶液用量为40m1时较佳。2.1.2正交试验结果根据单因素试验结果，设置正交试验的4因素3水平如表1所示，正交试验结果和方差结果如表2、3所示。表1CMC正交试验因素水平Tab.1Factorsand1eve1soforthogona1test水平1eve1因素factorA微波功率/Wmicrowave)wcrB微波时间minmicrowavetimeC40%NaOH总用量/m1tota1doseof4