高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程编制说明.docx

高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源2019年12月，云南省农业科学院甘蔗所申请高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程地方标准的立项，云南省市场监督管理局将其列入2020年度云南省地方标准制修订项目计划，批准由云南省农业科学院甘蔗研究所负责（牵头）高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程地方标准的制定。（二）起草单位云南省农业科学院甘蔗研究所（三）主要起草人主要起草人及任务分工见表1。表1主要起草人姓名性别职务/职称工作单位任务分工李婕女助理研究员云南省农业科学院甘蔗研究所项目负责人、统筹协调、标准文稿编写黄应昆男研究员云南省农业科学院甘蔗研究所技术指导、标准文稿编写单红丽女副研究员云南省农业科学院甘蔗研究所技术指导、标准文稿编写王晓燕女副主任/副研究员云南省农业科学院甘蔗研究所引物设计、PCR扩增、标准文稿编写张荣跃男副研究员云南省农业科学院甘蔗研究所试验数据分析、标准文稿编写仓晓燕女助理研究员云南省农业科学院甘蔗研究所资料收集整理、标准文稿编写王长秘男研究实习员云南省农业科学院甘蔗研究所PCR扩增、标准文稿编写尹炯男主任/副研究员云南省农业科学院甘蔗研究所样品采集、标准文稿编写罗志明男副主任/副研究员云南省农业科学院甘蔗研究所样品采集、标准文稿编写二、制定标准的必要性和目的意义甘蔗花叶病是一种重要的世界性甘蔗病毒病害，在中国蔗区发生最普遍，危害最严重，每年造成数以亿计的经济损失，严重制约了中国甘蔗产业的持续稳定发展。甘蔗花叶病病原复杂，可由多种病毒引起，前期研究表明引起甘蔗花叶病病原主要有甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)和甘蔗线条花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)3种，其中SCSMV和SrMV是目前引起中国蔗区甘蔗花叶病最主要的致病病原。高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯丫病毒属(Po(y切,在世界各大蔗区广泛分布流行，主要分布于印度、美国、巴西、阿根廷、日本、菲律宾、澳大利亚、中国等国家。2006年云南省农业科学院甘蔗研究所检测鉴定到SrMV,并发现该病毒寄主广泛、致病性强。目前，SrMV引起的甘蔗花叶病已成为云南蔗区发生最普遍，危害最严重的主要病害之一，常造成蔗株矮化、褪绿、分廉减少、生长缓慢、含糖量降低、产量下降，感病品种产量损失尤为严重,严重田块发病率高达100%,甘蔗感病后一般造成10%40%的产量损失，极大地制约着云南蔗糖产业持续稳定发展。由SrMV引起的甘蔗花叶病主要通过带病蔗种传播，也可通过摩擦和螃虫传播，防治难度较大，且引起甘蔗花叶病的病毒种类较多，发病症状相似，存在复合侵染现象，仅从症状上难以进行区分。甘蔗是无性繁殖作物，种茎带毒是SrMV的主要传播和扩散途径，生产上使用的蔗种没有严格选用无病蔗种，种苗带毒现象突出，促进了SrMV的积累和传播、扩散；收砍、耕作刀具未经消毒处理，交叉重复使用，有利于SrMV的交叉重复侵染。选育和种植抗病品种、生产和应用健康种苗是防控SrMV最经济有效的措施。而准确、快速的SrMV检测，是健康种苗培育和生产过程中花叶病监测不可或缺的关键技术，也是鉴定评价抗病品种的重要手段。由于缺乏标准化和规范化的SrMV检测技术,目前生产上种苗带病传播严重，抗病品种的选育、生产和应用健康种苗缺乏科学依据，导致甘蔗SrMV防控效率低下，严重阻碍着甘蔗生产发展。因此，建立一种科学、规范、标准的SrMV分子检测技术，为甘蔗病毒病样品诊断鉴定、健康种苗生产和应用、抗病品种选育提供科学化、标准化和规范化SrMV分子检测技术,为云南省甘蔗SrMV的分布、监测及及时掌握不同品种SrMV的发病状况等提供科学化、标准化和规范化分子检测技术手段，制定高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程十分必要。高粱花叶病毒RT-PCR检测目前尚无国家、行业标准，云南、广西等主产蔗区也无地方标准，缺乏科学化、标准化和规范化的SrMV检测技术支撑。自2006年云南省农业科学院甘蔗研究所在云南发现SrMV（登录号：DQ530434）以来，在开展SrMV寄主范围研究、致病性测定及蔗区发生危害调查的过程中，鉴定明确了SrMV的分类地位，完成了SrMV的系统发育分析，检测筛选到了SrMV强致病株系，研究建立了SrMV分子检测技术体系。随后利用该技术体系连续多年对蔗田间SrMV进行监测，对近2000余份甘蔗种质材料进行了SrMV抗性鉴定和评价。以上为制定高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程奠定了坚实的基础。高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程的制定，可以弥补SrMV检测技术标准的空白，实现SrMV早期检测，提高SrMV防控的科学性与准确性，在甘蔗品种/材料交换时，可有效避免SrMV随引进品种/材料进行扩散蔓延；为甘蔗品种抗性鉴定及评价提供规范、标准的检测技术；同时，本标准将为我国甘蔗花叶病防控提供技术支持，确保云南蔗糖产业的健康持续发展。三、主要起草过程（一）成立项目组自2020年2月获得立项后，云南省农业科学院甘蔗研究所立即组织成立了以李婕为主要负责人的高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程地方标准起草小组。其中，李婕为组长，组员包括黄应昆、单红丽、王晓燕、张荣跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明等。项目组首先确定了项目主要内容和技术指标，明确了项目组成员的任务分工。（二）资料收集和实验验证根据项目要求，项目组各成员按任务分工内容广泛查阅高粱花叶病毒检测相关文献，制定具体的实验方案。按照实验方案，分别以5个已知含高粱花叶病毒（SrMV）和5个组培脱毒的甘蔗样品为实验材料进行病毒检测，通过优化RNA反转录体系、PCR反应体系和反应条件，建立了高粱花叶病毒RT-PCR检测技术体系，并进一步评价了技术的特异性、灵敏度和重复性，开展了多种方法对检测技术的验证。（三）标准起草通过对前期研究、收集的资料和实验验证工作总结分析，确定了高粱花叶病毒RT-PCR检测的技术要求，参照标准编写格式起草形成初稿，经起草小组内部讨论修改后形成了标准征求意见稿。（四）同行专家意见征询将标准征求意见稿提交给与标准应用相关的高等院校、科研机构等单位进行标准意见征求。根据征求到的意见，标准起草小组逐条进行修改完善，最终形成标准送审稿及编制说明。四'制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系（一）制定标准的原则科学性原则。本标准利用反转录-聚合酶链式反应（简称RT-PCR)方法检测SrMVo以植物总RNA为模板，Oligo(dT)i8为反转录引物，利用反转录酶合成第一链cDNA,再以cDNA为模板，利用SrMV特异性引物，在出夕DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段,从而达到鉴定SrMV的目的，是在专业科研人员多次试验的基础上制定，并进行反复试验、验证，具有科学性。实用性原则。以前植物病毒鉴定主要通过田间症状观察和血清学检测，但是通过田间症状表现判断容易产生误判及漏诊。目前，国内外应用血清学检测甘蔗花叶病的技术已相当成熟，主要方法有双抗体夹心法(double-antibodysandwichELISA,DAS-ELISA),抗原直接包被间接酶联免疫测定技术(directantigencoatingELISA,DAC-ELISA)、酶联免疫斑点杂交法等。血清学反应检测方法具有快速、简单等特点，但由于需要病原特异性的抗血清，且灵敏度低于分子检测技术，因此仅适用于田间大量样品的检测。基于PCR原理的各种分子生物学检测技术已广泛应用于甘蔗病毒检测，如RT-PCR技术，RT-PCR是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR反应，以实现RNA分子上特定片段的扩增的方法，具有特异性强、灵敏度高、简单快速、检测样品量大、实用性强等特点，将为我国甘蔗科研、生产和检验检疫部门在甘蔗抗病品种选育、健康种苗生产应用、生产过程中花叶病监测及与国外开展甘蔗品种/材料交换或不同蔗区调种时提供科学、规范、标准、有效的SrMV检测技术方法，有效防控SrMV传播蔓延。规范性原则。标准文本符合GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的要求，格式规范。(二)与现行法律、法规、标准的关系本标准制定过程中主要依据GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的规定和要求制定。本标准与现行法律、法规和强制性国家标准无矛盾、冲突关系。五'主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述(一)检测方法的建立1 .引物设计病毒cp基因序列高度保守，常用于病毒株系的分类、检测和鉴定。本项目组根据前期对SrMV的测序结果和相关文献报道(蒋喜军等，植物病理学报，2009,39(2)：203-206),以高粱花叶病毒cp基因片段，设计了扩增SrMV的特异性引物SrMV-F：5,-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3'和SrMV-R：5'-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-37(R=A/G,Y=C/T)用于SrMV的检测。2 .反转录反应体系优化及RT-PCR灵敏度分析实验确定反转录最佳反应条件时，/TrcmsScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反转录试剂中的Oligo(dT)18Primer和RandomPrimer进行引物筛选；并进行了灵敏度分析实验，即用双蒸水按10倍比稀释SrMVRNA模板200ng/pL,稀释后以SrMV特异性引物SrMV-F/SrMV-R进行RT-PCR扩增。结果显示：Oligo(dT)i8Primer扩增效果比RandomPrimer灵敏,SrMV的RNA模板在稀释IO4倍后仍能扩增出目标条带(见图1)。图1SrMVRT-PCR反应体系优化及检测技术的灵敏度分析A：以Oligo(dT)i8Primer进行反转录的RT-PCR扩增结果；B：以RandomPrimer进行反转录的RT-PCR扩增结果；M：MarkerE；1-8：模板RNA稀释倍数分别为10°-10-73 .专化性实验分别以感染SCSMV和感染SCMV的甘蔗样品提取的基因组RNA为待测样品，以经过RT-PCR扩增和克隆测序分析为感染SrMV的甘蔗样品提取的基因组RNA作为阳性对照，以健康组培脱毒甘蔗样品提取的基因组RNA为阴性对照，以灭菌DEPC水为空白对照，对建立的RT-PCR技术体系进行专化性验证。结果显示,只有感染SrMV的甘蔗样品提取的基因组RNA出现820bp左右的目标条带，感染SCSMV和SCMV甘蔗样品提取的基因组RNA、阴性对照和空白对照均未出现目标条带(见图2)。bp1500-2PCNCCK8