丹参注射液对大鼠下颌骨骨折愈合过程中BMP-2和TGF-β1的影响.docx
丹参注射液对大鼠下颌骨骨折愈合过程中BMP2 和 TGFBi的影响向乐余伟Summary目的探讨丹参注射液对大鼠下颌骨骨折愈合的影响，并通过测量骨形成蛋白-2 (BMP-2)、转化生长因子-Bl (TGF-Bl)水平变化，探讨丹参促进下颌骨骨折愈合的械制。方法选取SD大鼠48只，通过双侧下颌骨体部造成颊舌侧贯穿不完全性骨折模型，按随机数字表法分为实验组和对照组，每组24只。实验组每天腹腔注射丹参注射液(1 mL/kg),对照组每天腹腔注射生理盐水。术后第1、2、3、4周，每组分别随机处死6只大鼠，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清BMP-2、TGF-Bl的含量。取出双侧下颌骨，右侧下颌骨行X线片检测骨折愈合情况并测量骨痂区的平均骨密度，标本经组织脱钙、石蜡包埋行HE染色后，采用骨组织形态计量学方法分析骨痂区骨小梁面积比、骨小梁宽度；左侧下颌骨骨痂，行组织粉碎，采用RT-qPCR技术检测BMP-2、TGF-Bl的表达情况。结果X线结果显示对照组骨折愈合明显延迟于实验组；从第2周开始，与对照组相比，实验组骨痂骨密度明显增加(P < 0.05或P < 0.01),骨痂区骨小梁面积比、骨小梁宽度显著性增大(P < 0.05或P <0.01)；差异随着愈合时间的延长而显著。ELISA结果显示，术后实验组血清BMP-2、TGF-B 1的浓度均高于对照组(P < 0. 05)。RT-qPCR结果显示，术后第2周开始，实验组骨痂中BMP-2及TGF-BlmRNA的表达均高于对照组(P <0.01) o结论丹参注射液促进下颌骨骨折愈合，可能与促进骨折愈合过程中BMP-2、TGF-B1基因的转录及蛋白表达有关。Key丹参注射液；下颌骨骨折；骨形成蛋白-2；转化生长因子-B1口 R285. 5 口 A 口 1673-7210 (2018) 08 (a) -0004-05Abstract Objective To investigate the effect of Danshen Injectionon mandibular fracture of healing in rat and observe the changes ofbone morphogenetic protein-2 (BMP-2) , transforming growth factor-0 1 (TGF-B 1) . Methods Forty-eight SD rats were operated forincomplete fracture of hibateral mandible penetrated from buccal sideto lingual side. The rats were divided into experimental group andcontrol group according to random number table, with 24 rats in eachgroup. The experiment group was administered with Danshen Injectionby intraperitoneal injection, and the control group was administeredwith physiologic saline by intraperitoneal injection. The righthealing of fracture were used to detect fracture healing by X-ray andto measure the average bone density of the callus area, the percenttrabecular and trabecular width were analyzed by bonehi stomorphometry and the serum levels of BMP-2, TGF-P 1 wasdetermined by ELISA at 1, 2, 3, 4 weeks after the operation. Theright healing of fracture were comminuted, and the expression ofBMP-2 and TGF-P 1 were analyzed by RT-qPCR. Results The X-ray resultsshowed that the fracture healing in the control group was obviouslydelayed in the experimental group. After 2 weeks, compared with thecontrol group, the callus bone mineral density (BMD) in theexperimental group was increased (P < 0. 05 or P < 0, 01) . Thetrabecular area ratio and trabecular width in the callus area weremarkedly increased (P < 0. 05 or P < 0. 01) , and the difference waseven more increased along with the increasing time. ELISA resultsshowed the serum levels of BMP-2 and TGF-P 1 in the experimentalgroup were higher than those in the control group (P < 0, 05) . RT-qPCR results showed the expression of BMP-2 and TGF-0 1 in theexperimental group were higher than those in the control group fromthe 2nd week after operation (P < 0. 01) . Conclusion DanshenInjection can promote the healing of mandibular fracture, which maybe related to the transcription and protein expression of BMP-2 andTGF-P 1 gene during the process of fracture healing.Key words Danshen Injection； Mandibular fracture； Bonemorphogenetic protein-2； Transforming growth factor-3 1下颌骨位于颜面下部，是颌面部体积最大且位置较为突出的骨骼。由于其解剖位置特殊，容易遭受外力而受损伤，据统计下颌骨骨折发生率占颌骨骨折的50%-70%lo下颌骨骨折愈合过程又较为复杂，受诸多因素的影响2,如饮食、年龄、损伤程度等。如何加快下颌骨骨折愈合成为口腔颌面外科医生关注的焦点。近年来，随着医学的发展，研究人员对下颌骨骨折愈合机制的认识不断拓展，中医药治疗下颌骨骨折取得了良好的效果。丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效，是一味重要的中药。前期研究表明，丹参能扩张血管、增加血流量，改善骨折处局部微循环3-4；促进成骨细胞增殖、分化5-6、同时抑制破骨细胞活性7-8。本研究基于前人理论，选用丹参注射液观察其对大鼠下颌骨骨折愈合的影响，并探讨其在下颌骨骨折愈合过程中的作用机制。1材料与方法1. 1实验动物清洁级SD大鼠48只，体重(250±50) g,由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK (鄂)2008-00051。大鼠自由饮水进食，标准普通饲料喂养。饲养于湖北医药学院动物实验中心清洁动物房，室温2325P,相对湿度50%70%。1. 2试剂与器械丹参注射液（四川升和药业股份有限公司，生产批号：160523）,骨形成蛋白-2 （BMP-2）及转化生长因子1 （TGF-B 1）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（重庆鼎国生物有限公司，生产批号均为201608）,数字X线平片机（SIEMENS,德国），KDIS影像处理软件，RM2235型石蜡切片机（Leica,德国），ABI7500型PCR仪，低速离心机（TD6M,高科仪器）。1.3 方法L3.1双侧下颌骨骨折的建立大鼠通过手术建立双侧下颌骨骨折模型9, 10%水合氯醛以3 mL/kg剂量进行大鼠腹腔麻醉后，剪去大鼠两侧下颌区及颈上部毛，暴露下颌体下缘及其颊舌侧面，以下颌第三磨牙后对应的下颌骨下缘为定点，螺状突顶点与定点，用低速手械（1500 r/s）制造宽1 mm,深3 mm的颊舌侧贯通的不完全离断性骨折模型。术中不断用生理盐水冲洗、冷却，术后将皮肤、皮下组织分层缝合。并与术后当日给予青霉素抗感染（1 mol/L, 20U/d）,连续 3 do1.3.2 动物分组48只大鼠按随机数字表法分为实验组和对照组，每组24只，常规饮食。在造模3 d后，实验组每天腹腔注射丹参注射液（1 mL/kg）,对照组每天腹腔注射等计量生理盐水。1.3.3 血清BMP-2、TGF-B1测定 术后第1、2、3、4周时，用水合氯醛麻醉大鼠，心脏取血，4静置4 h,离心机转速4000 r/min,离心半径10 cm,离心10 min后，提取血清，检测BMP-2、TGF-Bl含量。1.3.4 X线检查及骨痂区骨密度检测 术后第1、2、3、4周时，取右侧下颌骨标本，于X线机下拍摄正位片，观察骨折愈合程度；用KDIS影像处理软件对骨痂区行骨密度检测，计算出骨痂区的平均骨密度值。1.3.5 骨痂区组织形态计量学测定 将X线检查后骨痂标本置于4%的多聚甲醛液中固定(48 h) , PBS冲洗，然后在49下用EDTA溶液脱钙，可以用大针头轻轻刺进去者即脱钙完全10。石蜡包埋后切4 um薄片，HE染色。术后每个周期，两组选取6张切片，每个切片选择3个视野，每组共18个视野，采用Image-Pro Plus 6. 0图像测量与分析系统进行骨组织形态学指标(骨小梁面积百分比、骨小梁宽度)的测量9。1.3.6 总RNA的提取及逆转录按吕桂浩等11的方法，各组动物分批处死同时迅速取左侧下颌骨骨折处100 mg骨痂组织，液氮速冻、保存，并提取骨痂组织总RNA。引物由上海生工涉及、合成，引物序列见表1。按PrineScript RTreagent kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行RT-PCR,扩增反应采用20uL 体系：SYBR Premix Ex TaqII (Tli RnaseH Plus) 10 uL,上游引物(10 umol/L) 1 uL,下游引物(10 umol/L) 1 uL, cDNA 2 uL, d!I20 6pLo循环参数：模板cDNA 95P预变性30 s后进行循环。变性95P 5 s,退火60 30 s,延伸72 30 s,共进行
