《极地海冰生物检测样品的预处理方法》（报批稿）.docx

ICS 07.060CCS A45HY中 华 人 民 共 和 国 海 洋 行 业 标准HY/T XXXXX.2XXXX极地海冰生物检测样品的预处理方法Pretreatment method of polar sea ice samples for biological analysis点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（报批稿）（本稿完成日期：2020 年 12 月 1 日）XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施HY/T XXXXXXXXX目 次前言 II1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 试剂或材料 25 实验室环境及设备工具 26 海冰采集前准备 37 海冰采集 38 海冰分样 49 海冰融化 410 融化样预处理 411 样品保存 5附 录 A （规范性） 极地海冰生物分析样品预处理流程图 6附 录 B （规范性） 极地海冰生物分析样品预处理记录表 7参考文献 10IHY/T XXXXXXXXX极地海冰生物检测样品的预处理方法1 范围本文件规定了用于生物检测的极地海冰样品的现场采集、预处理和保存方法。本文件适用于在极地海域冰站上实施的海冰生物调查作业。在其他海域进行海冰生物调查作业可进 行参考。2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1极地 polar region南纬 60。以南、北纬 66°34（北极圈）以北的区域。3.2海冰 sea ice由淡水冰晶、卤水、气泡和生物等组成的混合体。3.3浮冰 pack ice南大洋和北冰洋中随风和海流漂移的海冰。3.4冰站 ice camp极地考察过程中选定的作为主要作业平台的浮冰。3.5冰芯 sea ice core利用手动或动力钻具钻取的圆柱状海冰样品。3.6海冰生物 sea ice organisms生活于海冰内部的生物。3.7冰藻 sea ice algae依附于海冰生存的藻类。3.8小型冰藻 sea ice micro-algae1HY/T XXXXXXXXX个体粒径介于 20 m50 m 之间的冰藻。3.9微型冰藻 sea ice nano-algae个体粒径介于 2 m20 m 之间的冰藻。3.10微微型冰藻 sea ice pico-algae个体粒径介于 0.2 m2 m 之间的冰藻。3.11中小型动物 meiofauna个体粒径介于50 m2000 m动物的统称。3.12海冰细菌 sea ice bacteria依附于海冰生存的原核生物。4 试剂或材料4.1 试剂除非另有说明， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1.1 超纯水：电阻率不小于 18 M cm（25) 。4.1.2 纯水： 电阻率不小于 0.1 M cm（25) 。4.1.3 液氮。4.1.4 稀盐酸（0.5 mol/L）：1 体积的质量分数为 37%的浓盐酸与 23 体积的超纯水混合。4.1.5 甲醛溶液（40%）。4.1.6 戊二醛溶液（25%）：将体积分数为 50%的戊二醛与超纯水按体积比 1：1 混合。4.1.7 鲁格试剂： 将 100 g 碘化钾溶于 1 L 超纯水中， 加入 50 g 碘使其溶解，再加入 100 mL 冰醋酸， 转移至棕色玻璃瓶中常温避光保存。4.1.8 过滤海水：使用 0.2 µm 孔径的聚碳酸酯膜对采集的极地海水进行过滤，收集经过滤的海水并 4 低温避光保存备用。4.2 材料4.2.1 尼龙滤膜：直径 47 mm、孔径 20 m。4.2.2 聚碳酸酯膜：直径 47 mm 、孔径 2 m 和 0.2 m。4.2.3 GF/F 滤膜：直径 47 mm、孔径 0.7 m 。4.2.4 尼龙材质筛绢： 孔径 50 m 和 20 m。4.2.5 冻存管：容量为 15 mL、5 mL 和 2 mL。5 实验室环境及设备工具5.1 实验室环境5.1.1 实验室内的温度、湿度等环境参数应符合仪器设备使用的规定。5.1.2 外界或内部的污染以及热、光等干扰水平应对样品处理无显著影响。5.1.3 应保持实验室洁净、整齐、有序，室温恒定。2HY/T XXXXXXXXX5.2 设备5.2.1 抽滤装置： 由单头或多头滤器（直径 50 mm）、抽滤瓶、真空泵（含负压表）等组成。5.2.2 低温冷藏室。5.2.3 超低温冰箱：最低温度 -80。5.2.4 通风橱：排风量1000 m3/h。5.2.5 马弗炉。5.3 工具5.3.1 冰芯钻系统：由切割头、钻管、延长杆、钻机等部分组成； 钻管直径不小于 9 cm、长不小于 100 cm，延长杆长 100 cm、配置不少于 2 根。5.3.2 冰芯盛管：PVC 材质的圆柱形空心管沿管口内径对半切割而成，单根长度与冰芯钻钻管等长（不 小于 100 cm），内径略大于钻管（若钻管直径为 9 cm，则套管直径建议为 10 cm），并在外壁标注长 度标尺，配置不少于 6 个。5.3.3 冰锯： 不锈钢材质手工锯，锯路宽 1 mm，锯齿齿长不小于 5 mm，锯齿齿距不小于 5 mm。5.3.4 不锈钢铲。5.3.5 量筒： 10 mL、100 mL、500 mL、1L 和 2 L。5.3.6 烧杯：1L。5.3.7 透明玻璃瓶：250 mL。5.3.8 棕色玻璃瓶：500 mL。5.3.9 冰芯容器： 聚四氟乙烯材质，不透光，容积大于 2 L，开口不小于 10 cm。5.3.10 运输箱：密封、 不透光。5.3.11 温度计：温度下限-20 , 准确度 0.1。5.3.12 麻花钻：由钻头、钻杆、钻机等部分组成；钻杆 3 根、 直径 5 cm、长度 100 cm。5.3.13 量冰尺：3 m，准确度 1 mm。6 海冰采集前准备6.1 根据极地海冰生物分析样品预处理流程图（见附录 A 图 A. 1），熟悉海冰采集和样品预处理方法。6.2 将 GF/F 滤膜（见 4.2.3）用锡箔纸包好， 置于马弗炉（见 5.2.5）中 450灼烧不少于 4 h，取出放 入干燥器中保存待用。6.3 分别使用淡水、纯水（见 4.1.2）、超纯水（见 4.1.1）对冰芯钻切割头和钻管 （见 5.3.1）内外表 面、冰芯盛管（见 5.3.2）冰锯（见 5.3.3）、不锈钢铲（见 5.3.4）、量筒 （见 5.3.5）、烧杯（5.3.6）、 玻璃瓶（见 5.3.7 和 5.3.8）进行冲洗，晾干后备用。冰芯容器（见 5.3.9）应事先用稀盐酸（见 4.1.4） 浸泡 24 h，然后用超纯水（见 4.1.1）洗涤 3 次，在阴暗的环境下晾干备用。7 海冰采集冰芯样品用冰芯钻（见 5.3.1）按下列步骤采集。a) 宜选择平均厚度1 m 以上、平整作业面直径100 m 的开阔海冰作为冰站，以便于考察船舶停 靠、物资搬运和现场人员登冰采集海冰样品。然后在冰面选取较平整和开阔的位置作为采样点。b) 用温度计（见 5.3.11）测定采样现场气温， 然后用麻花钻（见 5.3.12）钻穿海冰，将量冰尺（见3HY/T XXXXXXXXX5.3.13）伸入钻孔中测定海冰厚度。c) 用不锈钢铲（见 5.3.4）铲除采样点及周围的表面积雪。d) 使用冰芯钻（见 5.3.1）垂直钻取冰芯；应弃用最初采集的 2 支冰芯，确保避免来自于存储和运输冰芯钻过程中可能的污染。e) 冰芯钻取次数应视海冰厚度而定：1) 在海冰厚度小于 1 m 时， 宜一次性钻取完整冰芯；2) 在海冰厚度大于 1 m 时， 需分次钻取冰芯：第一次钻取长度小于 90 cm 的冰芯， 将冰芯样 品转入预先准备好的冰芯盛管（见 5.3.2）中临时存放。随后接入延长杆继续钻取剩余冰 芯，直至获取完整冰芯；f) 钻取的冰芯应保证其连续性和完整性。g) 在同一站点重复钻取不少于 6 支冰芯。对同一站点的样品，钻孔间距不超过 0.5 m。8 海冰分样冰芯样品按下列步骤在冰站现场分样。a) 取 1 支冰芯平放于冰面，从冰表到冰底用冰锯（见 5.3.3）沿平行于冰表方向按 20 cm 一段切 割冰芯。其中冰芯底部末段保留 5 cm，次末段如果长于 10 cm 则按单独一段处理， 次末段如 果小于 10 cm 则并入上一段， 同时做好样品编号等相应记录。每段冰芯切割结束后应及时清理 冰锯，以避免后续样品被污染。b) 如果遇到冰芯断节， 应先判断断节形成原因：1） 如果断节为天然原因（如冰下融洞） 造成，则应将断节上部（断节处至冰表）和断节下部 （断节处至冰底）视为两段冰芯，按照 8 a）步骤分别处理，并做好记录；2） 如果断节为钻取冰芯时受外力作用造成， 则应将其视为一段冰芯， 按照 8 a）步骤处理；c) 冰芯切割好后，应将各段冰芯样品分开储存于冰芯容器（见 5.3.9）内，同时记录分段和容器序号等信息，记录格式见附录 B 表 B.1。d) 取第 2 支冰芯进行分样， 操作步骤重复 8 a）至 c）。e) 另取 1 支冰芯， 仅取末段 5 cm，与第 1 支冰芯末段合并，用于叶绿素浓度分析。f) 另取 3 支冰芯， 均仅取末段 5 cm，与第 2 支冰芯末段合并，用于生物类群分析的。 g) 用运输箱（见 5.3.10）将分割后的冰芯样品运回实验室， 立即进行海冰融化。9 海冰融化根据分析目标的不同，对海冰采取不同的融化方法：a) 海冰叶绿素浓度分析：将装有分段冰芯样品的容器放置于实验室内避光融化；b) 海冰生物类群分析：向装有分段冰芯样品的容器中按比例（每 20 cm 冰芯加入 1 L）加入过滤 海水（见 4.1.8），然后将样品转移至 4低温冷藏室（见 5.2.2）内避光等渗融化。10 融化样预处理密切关注冰芯融化情况， 待冰芯完全融化后， 立即按下列步骤进行预处理。a) 叶绿素融化样：首先根据样品体积选择量程合适的量筒（见 5.3.5）量取叶绿素融化样的体积，然后使用 GF/F 滤膜（见 4.2.3）进行过滤，或使用尼龙滤膜（见 4.2.1）、2 m 聚碳酸酯滤膜（见 4.2.2）和 GF/F 滤膜（4.2.3）进行分级过滤，样品还剩约 5 mL 时用超纯水（见 4.1.1）清洗滤4HY/T XXXXXXXXX器壁。抽滤时负压应小于 30 kPa，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子小心地取下滤 膜， 将其对折（有生物样品的一面向里），将滤膜装入 15 mL 冻存管（见 4.2.5）中，记录过滤 信息于附录 B 表 B