高效液相色谱柱的选择.docx

高效液相色谱柱的选择一、硅胶基质填料1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Si1iCa)以及其他具有极性官能团胺基团，如(NH2,APS)和氟基团(CN,CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正己烷(Hexane),氯仿(Ch1oroform),二氯甲烷(MethyIeneChIoride)等。2、反向色谱反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙晴等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Buty1)>C6H5(PhenyI)二、聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯一二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为114均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。三、其它无机填料其它HP1C的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般给于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HP1C流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HP1C。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强,应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化错基质填料也可用于HP1Co商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化倍微球色谱柱，应用PH1-14,温度可达IO由于氧化错填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。怎样选择填料粒度目前，商品化的色谱填料粒度从Ium到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是主要的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短,以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙月青代替甲醇，以降低色谱柱的压力。