2024枫糖尿病患者家系基因突变分析及产前诊断.docx

2024枫糖尿病患者家系基因突变分析及产前诊断摘要目的分析枫糖尿病(map1esyrupurinedisease,MSUD)患者家系基因突变情况以及对产前诊断的作用。方法2005年至2010年间,共诊断4例MSUD患儿其中男婴和女婴各2例,发病年龄分别为生后2、5、10和26d。利用聚合酶链反应技术扩增BCKDHAsBCKDHB基因外显子编码区序列,直接测序分析4例患儿BCKDHAsBCKDHB基因的突变情况。在患儿母亲再次妊娠16-20周时抽取羊水细胞,对培养后的羊水细胞进行相应基因突变检测,用于产前诊断。结果4例患儿中共检测到6种不同的基因突变包括4种新突变(c.308T>Cc.562G>Tsc.1279C>Gxc.1280-1291de112)o其中在3个家系的BCKDHA基因上检测至U5种突变(c.308T>Cc.562G>Tsc.868G>Asc.1279C>G及c.1280-1291de112),另一个家系在BCKDHB基因上检测到c.853C>T1个突变。4例患儿母亲再次妊娠羊水细胞中均检测到1个先证者携带的突变提示胎儿为MSUD杂合子。结论通过家系BCKDHAsBCKDHB基因分析,初步了解MSUD患者的基因突变情况,并成功应用于产前诊断,为MSUD家庭提供帮助。【关键词】枫糖尿病;3-甲基-2-氧代丁酸脱氢酶(硫辛酰胺);系谱;产前诊断枫糖尿病(map1esyrupurinediseasezMSUDzOMIM248600)是一种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缴氨酸)代谢紊乱疾病,属于常染色体隐性遗传病,是由于支链0®酸脱氢酶复合体(branched-Chain-ketoaciddehydrogenaseCOmP1eX,BCKD)活性降低导致的一种罕见疾病,其总体患病率约为1：1850001,但在门诺派教徒人群患病率较高,为1：3802o此复合体由支链o®酸脱竣酶(branchedchain-ketoaciddecarboxy1asezE1)xb支链酮酸脱竣酶(branched-ChainB-ketoaciddecarboxy1asezE1B)和双氢脂酰转环酶(1ipoate-bearingdihydroIipoy1transacy1asezE2)ME单位组成,其编码基因分别为bckdhazbckdhb及dbt,其中任何一个基因发生突变都会导致此病。由于BCKD酶活性降低,造成支链氨基酸和支链酮酸积聚在体内,对脑组织产生神经毒性作用导致进行性神经退化性病变。BCKD是由E1aE2、特异性激酶和特异性磷酸酶组成的立方体结构,由6条基因的编码产物构成。根据基因突变MSUD分为Ia型(OM1M608348)(编码E1o6Z基的BCKDHA基因突变)、Ib型(OMIM248611)(编码E邛亚基的BCKDHB基因突变)、II型(OM1M248610)(编码E2亚基的DBT基因突变)、HI型(OM1M238331)(编码E3亚基的D1D基因突变)1,IV型和V型分别为特异性激酶和磷酸酶基因突变型。迄今有关BCKDHA、BCKDHBsDBT的基因突变报道已有150余种,E3基因突变报道较少。本研究4例中国MSUD患儿及其父母进行BCKDHAsBCKDHBsDBT基因突变检测,并对这4个家系进行产前诊断。资料与方法一、研究对象及诊断标准MSUD患儿4例,男2例女2例,发病年龄分别为生后2、5、10和26d,发病日期分别为2005年3月17日、2010年8月2日、2005年10月24日、2008年6月23日。1例家系父母为近亲婚配,其余3例家系父母非近亲婚配。2例由上海交通大学医学院附属新华医院诊断,2例由山东省青岛市妇女儿童医疗保健中心诊断。诊断标准:（1）发病时喂养困难、嗜睡、肌张力异常、抽搐、尿中焦糖样异味等;（2）血串联质谱检测亮氨酸（正常值50300mo11）x级氨酸（正常值60250mo11）增高及尿检测多种酮酸增高；（3）基因检测发现突变位点口。这4例患儿母亲再次妊娠时,要求进行产前诊断。签署知情同意书后行家系基因突变分析和产前诊断。二、研究方法1 .外周血白细胞采集:征得患儿家长同意后,取患儿及其父母外周静脉血,分离白细胞,提取DNAo2 .羊水细胞采集及培养:患儿母亲再次妊娠（均是与同一配偶妊娠）1620周时经羊膜腔穿刺术抽取羊水20m1,取2m1用于气相色谱质谱检测支链酸,其余羊水添加培养因子及20%胎牛血清培养23周后收集细胞进行BCKDHA及BCKDHB基因突变检测。3.BCKDHAsBCKDHB基因检测:首先对患儿和其父母基因组DNA进行基因检测,然后对羊水细胞进行相应突变检测。BCKDHA基因包含9个外显子,BCKDHB基因包含10个外显子,应用Primier5.0软件参照文献对BCKDHA基因和BCKDHB基因编码区分别设计了9对和10对引物。扩增反应体系为50上包含20Ong基因组DNA、51dNTPs(1.25mo11)J1引物(12.5mo11),51IOxTaqDNA聚合酶缓冲液、1M1TaqDNA聚合酶、加灭菌蒸储水至终体积501o反应条件如下：95。C预变性1minz95oC变性30s,5660°C退火30sz72oC45s进行34个循环,72。C再延伸10mino经纯化后进行DNA测序(ABI377测序仪,上海生工生物公司)。测序结果采用Chromas软件分析,并与GenBank人类BCKDHA基因(NM,000709)xBCKDHB基因(NM_000056)进行比较,突变外显子均行双向测序。结果一、临床资料4例患儿均在新生儿期发病川缶床表现为经典型,主要有呕吐、嗜睡、纳差、惊厥、肌张力增高、喂养困难等症状,其中2例患儿头颅磁共振检查发现脑内广泛异常信号影。4例患儿对维生素B1治疗均无反应,只能用不含亮氨酸、异亮氨酸及缴氨酸的营养粉治疗。4例患儿中1例诊断后不久未及时治疗死亡;余3例接受治疗,1例依从性较差,间断治疗，2例依从性较好，坚持治疗并定期随访。发病后随访时间16年,治疗后的3例患儿仍有智力落后、运动发育迟缓等表现,其中间断治疗的患儿智力落后更严重,表现为不会说话、运动障碍。二、BCKDHAsBCKDHB基因突变检测结果4个家系的基因突变检测结果见图1及表3。1号家系患儿仅检测到1个BCKDHA基因突变,且羊水细胞检测到1个相同的突变,未检测到其他突变;其余3个家系患者均检测到2个突变,羊水细胞均检测到1个突变。患儿母亲再次妊娠羊水细胞中分别检测到1个先证者携带的突变,提示胎儿为MSUD杂合子。家系2和3的突变均发生在BCKDHA基因上,家系4的突变发生在BCKDHB基因上。另外,2号家系患儿、父亲和胎儿携带多态性位点c.972C>T(F324F)4xc.1221A>G(14071)(HGVbaSeSNPOoOOo8700)均为同义突变。讨论MSUD根据发病时间和病情进展情况可以分为5型:(1)经典型;(2)中间型;间歇型;维生素B1有效型X5)二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶缺乏型。本研究4例患儿均于新生儿期出现嗜睡、喂养困难、尿异味等症状,并出现惊厥、肌张力增高等神经系统症状,其中1例患儿1月龄时因难治性酸中毒死亡。综合以上特点,可明确该4例患者均为经典型。由于经典型MSUD患者新生儿期常出现反应差、嗜睡等非特异性症状,因此对疑似患者应及时进行血、尿氨基酸检测以便早期诊断。本科室曾报道利用串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测诊断该病几本研究4例患者在新生儿期即通过血串联质谱及尿气相色谱-质谱技术检测得以诊断。患儿血中亮氨酸显著增高,最高水平达正常参考值上限8倍以上;缴氨酸和亮氨酸/苯丙氨酸比值亦明显增高。尿气相色谱-质谱检测尿中Cf同酸发现,尿中2-羟基异戊酸、2-酮异戊酸、乙酰乙酸、2-酶-3-甲基戊酸、2-酶-异己酸及乙酰甘氨酸均显著高于正常参考值。经典型MSUD需要早期治疗,强调诊断后立即干预,从而改善其预后。本研究中,1例患者于新生儿期死亡,1例患儿因家长放弃治疗,智力严重落后,余2例治疗依从性较好,但仍出现智力落后、运动发育迟缓等神经系统损害表现,可能与胎儿期及新生儿期中枢神经系统受损有关。故对于新生儿期无明确原因出现神经系统异常者,需要尽快进行血串联质谱及尿气相色谱-质谱检测以便早期诊断早期治疗。由于MSUD是致死、致残的遗传性疾病，治疗困难,且预后不良。对于有生育MSUD患儿风险的夫妇进行产前诊断,是防止MSUD患儿出生的重要手段。通过对MSUD先证者进行基因诊断,再为先证者母亲妊娠后进行产前诊断,可提高产前诊断的准确性。有关MSUD基因突变研究,目前文献已报道150余种,不同种族存在不同的热点突变。发病率最高的门诺派教徒社区最常见突变为BCKDHA基因C1312T>A(p.Y393N)该突变预计携带率高达10%2;也有报道其他源自同一祖先的非门诺派教徒人群常见突变为c.1312T>A(p.Y393N)70葡萄牙报道在吉普赛社区BCKDHA基因热点突变为c.117de1C(p.R40GfsX23)8o亚洲人群中,韩国报道了3例MSUD患者5个位于BCKDHA基因上的突变9;泰国有!例BCKDHA基因产前诊断的报道10,胎儿及父母携带C529C>T(p.Q177X)无义杂合突变;中国地区尚未检索到有相关突变类型和频率的报道。本报道4例患儿中的1号、2号、3号家系患者基因突变存在于BCKDHA上,确诊B为MSUDIa型,4号家系患者基因突变存在于DKDHB上,确诊为MSUD1b型。BCKDHA基因上常见突变c.868G>A(pG290R),初由Chuang等11报道1例轻型患者携带纯合突变(报道为p.G245R),2006年Rodnguez-Pombo等12报道2例症状较重的间歇型携带杂合突变。本研究中,1号家系携带该突变。G290-可以保证支链o0同酸脱氢酶复合体的环状结构的紧密结合，G290-位于亚单位-'表面结合袋,推测G290R突变妨碍了保。亚单位的结合,由此导致o22亚单位之间的组装错误而引起酶活性下降12。葡萄牙人群中的热点突变c.117de1C(pR40GfsX23)弓|起读码框移,在下游23个密码子处出现终止密码子，形成截短蛋白,仅含61个氨基酸残基限快从线粒体中被清除口3。同时,由于终止密码子出现在非常靠前的位置上,所以相应的mRNA被无义介导降解清除甚至不产生截短蛋白口4。本研究发现的BCKDHA基因突变中,除了c.1280-1291de112突变外,c.308T>C(p.1103P)sc.562G>T(p.G188W)sc.868G>A(p.G290R)sc.1279C>G(p1427V)突变均为错义突变。根据E1的晶体结构,1103-a可能在疏水核的临界位点,在这个位点上,4个环状结构通过疏水键结合在一起。该位点突变1103P可能打破疏水核的结构15。G188-a位于亚单位结合区G188W突变可导致E1亚单位组装异常从而影响酶活性。3号家系患儿的基因型为c.308T>C(1103P)+562G>T(G188W),出生后26d发病,临床表型为经典型,提示这2个致病突变对酶活性影响较大。c.1279C>G(p1427V)和c.1280-1291de112(p.14271fsX20)发生在C-末端残基处,C-末端残基的突变影响亚基的正确组装和22的自然结构形成。同时,1427-f立于亚单位结合区的延伸端该延伸端对酶的催化中心的活性至关重要16。所以无论是该区域的错义突变还是缺失突变,都严重影响酶活性,与基因型c.1279C>G(1427V)+1280-1291de112(14271fsX20)相一致。4号家系突变位点为c.853C>T(p.R285X)该突变为已报道突