基于网络药理学探究黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证.docx
基于网络药理学探究黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证马旭东1杨进2陈林2/吴波3李嘉产王威威Y梁国标I（1.遵义医科大学贵州遵义563000；2.成都大学附属医院；3.郸都区人民医院）摘要：目的：利用网络药理学、生物信息学，研究黄杨碱抑制肾癌的作用机制，并通过人肾癌细胞系786-O,CakiT进行体外实验验证相关预测结果。方法：首先从PharmMaPPer数据库检索黄杨碱（CVB-D）的作用靶点，DiSGeNET数据库获得肾癌疾病靶点，随后通过venny平台整合CVB-D治疗肾癌的潜在靶点，把潜在靶点导入String数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络（PPI）,然后将String数据导入CytoSCaPe中修饰，并用CytoHUbba插件进一步分析网络中的Hub基因，得到的Hub基因用TCGA数据库作表达差异及生存分析。此外再用CVB-D与肾癌的交叉靶点数据进行GO和KEGG富集分析，得到黄杨碱治疗肾癌的潜在靶点中的分子功能及相关作用信号通路等分析结果。最后采用CCK-8、克隆形成、观察细胞形态实验、WeSternb1ot实验验证CVB-D对肾癌的作用结果。结果：分析得到CVB-D潜在作用靶点136个，疾病作用靶点2085个，CVB-D治疗肾癌的预测作用靶点68个，核心靶点5个。靶点共涉及生物过程238种，细胞组成30种，分子功能59种，参与肿瘤、PI3K-AKT,前列腺癌等细胞信号通路222条；CCK-8、克隆形成、细胞形态实验结果表明，与对照组相比，CVB-D能显著抑制肾癌细胞的活力与增殖能力，呈浓度依赖性；流式细胞凋亡分析表明CVB-D能促进肾癌细胞凋亡，从而抑制肾癌细胞；Westernb1ot实验表明CVB-D作用后细胞中EGFR、p-PI3K,p-AKT相对表达水平降低，呈浓度依赖性，与空白组相比存在统计学差异（P<0.05）o结论：黄杨碱可能通过EGFR靶点和PI3K-AKT信号通路诱导人肾癌细胞凋亡，从而在肾细胞癌的治疗中发挥重要作用。关键词：网络药理学；生物信息学；黄杨碱；肾细胞癌；表皮生长因子受体；PI3K-AKT通路Exp1orationofthemechanismandexperimenta1verificationoftheinhibitoryeffectofCyc1ovirobuxineDonrena1ce11carcinomace11sbasedonnetworkpharmaco1ogyMaXudong1,2,YangJin2,Chen1in成都大学附属医院攀登人才计划（编号：RCJH-01-04）；成都优秀卫技人才发展专项资金；成都市医学科研课题（）；成都大学临床医学院附属医院创新团队项目（CDFYCX202307）通信作者Te1:E-mai1:,WuBo3,1iJia1,2,WangWeiwei1,2,1iangGuobiao1,（1.ZunyiMedica1University,Zunyi563006,China;2.Affi1iatedHospita1ofChengduUniversity;3.PiduDistrictPeop1e,sHospita15Chengdu）ABSTRACTObjective:TostudythemechanismofCyc1ovirobuxmeDinhibitingrena1carcinomawithnetworkpharmaco1ogyandbioinformatics,andverifyingthepredictedresu1tsthroughhumanrena1carcinomace111ines786-0,Caki-Iinvitro.Methods:First1y,retrievingthetherapeutictargetsofCVB-DfromPharmMapperdatabase,andtherena1cancertargetsfromDisGeNETdatabase.Thenintegratingthepotentia1targetsofCVB-Dforthetreatmentofrena1cancerthroughVennyp1atform,andconstructingtheprotein-proteininteractionnetwork（PPI）throughStringCytoHubbap1ug-ininCytoScapewasusedtofurtherana1yzeHubgenesinthenetwork.Afterwards,ana1yzingtheexpressiondifferencesandsurviva1ofHubgenesbyTCGAdatabase.Furthermore,thedataofthepotentia1targetsofCVB-Dforthetreatmentofrena1cancerwereana1yzedbyGOandKEGGenrichmentana1ysis,andthemo1ecu1arfunctionsandre1atedsigna1ingpathwaysofpotentia1targetsforthetreatmentofrena1cancerbyCVB-Dwereobtained.Fina11y,cck-8,C1onogenesis,ce11morpho1ogyandwesternb1otwereusedtoverifytheeffectofCVB-Donrena1carcinoma.Resu1ts:136potentia1targetsofCVB-D,2085diseasetargets,68predictivetargetsofCVB-Dinthetreatmentofrena1cancer,and5coretargetswererecognizedafterana1ysis.Targetsarere1atedto238kindsofbio1ogica1processes,30kindsofce11compositions,59kindsofmo1ecu1arfunctions,andparticipatedin222ce11signa1ingpathwayssuchastumor,PI3K-Akt,prostatecancerandsoon.Comparedwiththecontro1group,CVB-Dcansignificant1yinhibittheviabi1ityandpro1iferationofrena1carcinomace11sinaconcentration-dependentmanner.F1owcytometryana1ysisshowedthatCVB-Dcou1dpromotetheapoptosisofrena1carcinomace11sandinhibittherena1carcinomamb1otexperimentshowedthatthere1ativeexpression1eve1ofEGFR、p-PI3Ksp-AKTince11streatedwithCVB-Ddecreasedinaconcentrationdependentmanner,whichwasstatistica11ydifferentfromthatintheb1ankgroup(P<0.05).Conc1usion:CVB-Dmayp1ayanimportantro1einrena1ce11carcinomabyregu1atingce11pro1iferationandapoptosisthroughPI3K-Aktsigna1ingpathwayandEGFR.Keywords:Networkpharmaco1ogy;Bioinformatics;Cyc1ovirobuxineD;Rena1ce11carcinoma;Epiderma1growthfactorreceptor;PI3K-AKTpathway肾细胞癌是泌尿系统最常见和最具风险的肿瘤之一，约占全世界所有确诊癌症数的5%m,主要发生在男性中.并且在未来几年中，肾细胞癌(rena1ce11carcinoma,RCC)的发病率和死亡率仍将继续攀升，至2040年全球肾癌死亡人数估计高达30多万.肾细胞癌可以被分为不同的分子和组织学亚型。透明细胞癌，乳头状肾细胞癌和嫌色细胞癌是肾细胞癌中最常见的亚型(?90%),而剩余的亚型W10%。重要的是，每种亚型在预后和治疗方面都具有特异性。由于缺乏早期症状，大量肾细胞癌患者在发现时已经有远处转移，手术治疗困难。因此，药物治疗对于大多数肾细胞癌患者非常重要。近年来，随着技术的进步和国内外研究者的不断努力，不断涌现出许多有潜力治疗肾细胞癌的新疗法，例如针对哺乳动物雷帕霉素靶点(mT0R)和蛋白酪氨酸激酶(RTK)信号的靶向治疗。最近，基于免疫治疗的新策略也被开发出来，旨在针对癌症免疫细胞之间的相互作用(免疫检查点抑制剂)，这种方案在ReC治疗中取得了一些成功。虽然使用免疫治疗的患者生存率明显高于单独化疗，但总体预后仍较差。因此，迫切需要找到一种新的、有效的抗肾细胞癌的药物。已有证据表明，一些天然产物具有确切的治疗作用，如抑制细胞增殖，诱导凋亡和促进线粒体损伤，促进氧化应激"刈。黄杨碱(Cyc1ovirobuxmeD,CVB-D)是一种生物碱，来源于中国黄杨和其他同属植物。已发表的研究表明，CVB-D能通过CTHRC1-AKT/ERK-Snai1信号通路抑制结直肠癌的发展。止匕外，CVB-D在胃癌细胞、乳腺癌细胞中都有一定的抑制作用皿)综上，目前CVB-D的抗癌作用和详细机制较为复杂。而CVBF对肾癌的具体作用及机制尚不明确。随着生物信息学领域的发展，网络药理学在药物发现及其设计过程方面有了显著的进步口、使得网络药理学的预测结果可为新药研究的进一步研究方向提供理论依据。因此，本研究首次采用网络药理学、生物信息学方法，建立靶点-疾病网络，探讨CVB-D治疗肾细胞癌的核心靶点、生物学功能、途径和机制，希望进一步明确CVB-D在肾癌中的具体作用机制，来为肾癌治疗寻找新的靶点。1 .材料与方法1.1 网络药理学与生物信息学分析1.1.1 黄杨碱的预测靶点从PhamIMaPPer()数据库筛选黄杨碱的潜在治疗靶点。基因符号名称在UniprotKB数据库。中手动规范化。1.1.2 肾癌的潜在靶基因肾癌相关的靶基因来自DiSGeNET()o搜索策略:设置关键字为"rena1ce11carcinoma,物种确定为智人。1.1.3蛋白互作网络构建为了阐明黄杨碱药物作用靶点与肾癌靶点之间的相互作用，使用Venny2.1.O在线软件O获得交集基因并绘制Venn图。然后将交集靶点基因提交到STRING11.O数据库(https"/),构建蛋白质-蛋白质相互作用(PP1)网络模型，将生物物种设置为智人(HOmosapiens),最小相互作用阈值设置为中置信度(>0.4)o通过CytoSCaPe7.2)调整并作图，再使用CytoHubba插件进一步分析网络中的Hub基因。1. 1.4富集分析使用基因本体论(GO)分析和京都百科全书(KEGG)通路富集分析用来探索生物学途径和潜在的功能。将交集靶点基因分别输入到DAVID数据库。和KEGG数据库O,限定物种为人，设置PVO.05,分析主要的生物过程和代谢途径，并进行富集分析，保存结果，并使用微生信O在线工具将数据可视化。1.1. 5核心靶点基因生物信息学分析从癌症基因组图谱(TCGA)数据集()获得肾透明细胞癌的RNAseq数据(IeVe和相应的临床信息。GTEX数据来自V8版本O。使用R软件v4.0.3进行统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。并利用基因表达分析交互分析数据集(GEP1A,)进一步
