万古霉素高产菌株选育及发酵配方优化.docx
万古霉素高产菌株选育及发酵配方优化王会会程启东戴梦赵建强任风芝葛鹃鹏张志江摘要：为了提高东方拟无枝酸菌产万古霉素的发酵单位，降低生产成本，采用紫外诱变、常压室温等离子体诱变对东方拟无枝酸菌出发菌株V19-02进行诱变处理，通过筛选链霉素抗性突变菌株，选育高产菌株;通过对发酵培养基中碳源和氮源进行筛选，选取葡萄糖、淀粉、低温豆粉、酵母粉4个因素进行均匀设计。结果表明，获得的高产菌株V19-1-07摇瓶发酵单位提高33. 7%,且具有良好的传代稳定性;优化后的培养基配比质量分数为葡萄糖8. 0%.淀粉1.0%、低温豆粉L0%、酵母粉4.0%、氯化钠1.0%,磷酸二氢钾0.1%；小试结果证明，优化配方可使50L罐发酵单位平均达到14110 gmL,比原始配方提高了 28. 9%o因此,研究获得的高产菌株V19-1-07可应用于万古霉素工业化发酵生产，以帮助企业降低成本，进一步提高竞争力。关键词：发酵工程;万古霉素；复合诱变；菌种选育;均匀设计;东方拟无枝酸菌中图分类号：TQ465. 9文献标识码：ADOI： 10. 7535/hbgykj.2022yx03011BreedingofhighvancomycinproducingstrainsandoptimizationoffermentationformulaWANGHuihuil, 2, 3, CHENGQidong4, DAIMengl, 2, 3,ZHA0Jianqiang4, RENFengzhil, 2, 3,GEKunpengl, 2, 3, ZHANGZhijiang4( 1. NewDrugResearchDevelopmentCompany , NCPC ,Shijiazhuang,Hebei052165,China；2. NationalEngineeringResearchCenterofMicrobiaIMedicine , Shijiazhuang ,Hebei052165,China；3. Hebei IndustryMicrobialMetabolicEngineeringTechnologyResearchCenter , Shijiazhuang, Hebei052165 ,China； 4. HuashengCompany , NCPC , Shijiazhuang ,Hebei052165, China)Abstract：InordertoincreasetheyieldofvancomycinbyAmycolatopsisorientalisandreducethecost,theoriginalstrainAycolatopsisorientalisV19-02wastreatedbyUVandatmosphericandroomteniperatureplasnias(ARTP ) . Highyieldstrainswereselectedbyscreeningstreptomycinresistancetreatment. Meanwhile,thecarbonsourcesandnitrogensourcesoffermentationmediumwereoptimizedandfourfactorsincludingglucose,starch,low-temperaturesoybeanpowderandyeastpowderwereselectedforuniformdesignexperiment. Theresultsshowthattheyieldofvancomycinfermentationofthehigh-yieldmutantstrainAmycolatopsisorientalisV19-l-07isincreasedby33. 7%inflaskculture. Inaddition ,thestrainhasanexcellentpropagatingstability. Theoptimalfermentationmediumisasfollows ： glucose8.0% ,starchi. 0% , low-temperaturesoybeanpowderl. 0% ,yeastpowder4.0% , NaCll. 0% ,KH2P040. 1%. Theexperimentalresultsshowthattheproductionofvancomycinreachsl4110 g/mLundertheoptimalconditionsbythestrainV19-l-07in50Lfermentor ,whichis28. 9%higherthantheoriginalformula. Afterappliedtolarge-scaleproduction ,itisconductivetoreducethecostandimprovethecompetitivenessofenterprisesfurther.Keywords：fermentationengineering；vancomycin；complexmutagensis；strainbreeding；uniformdesign；Amycolatopsisorientalis离古霉素(vancomycin)由东方拟无枝酸菌发酵所得，其通过抑制细菌的生长和繁殖来杀死细菌1,是临床上用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的严重感染疾病的重要药物2。万古霉素的应用日渐增多，在巨大的市场前景下，提高发酵单位、降低生产成本，有利于企业在竞争中占据有利地位3-4。中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。江苏海阔生物医药有限公司5采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9gL,且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92. 7%；北大方正集团有限公司等6通过在发酵过程中每天补加0.1%0.5% （质量分数）的硫酸铁，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9500 g/mL以上，最高可达到10157 g/mL。常压室温等离子体（atmosphericandroomtemperatureplasma, ARTP） 具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效7。关亚鹏等8应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了 42.9%。本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsisorientalis） V19-02 进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基,进一步提高万古霉素的发酵单位。1材料1. 1菌种研究所用（Amycolatopsisorientalis） VI9-02,由华北制药华胜有限公司提供。1. 2培养基1）种子培养基（除pH值外，其余物含量均为质量浓度）葡萄糖为 20. 0gL,蛋白陈为 5. 0gL,NaCl 为 5. 0gL,K2HP04为 0. 3gL, pH 值为 7.07.2o2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）葡萄糖为30. Og/L,工业淀粉为80. Og/L,酵母粉为10. Og/L,低温豆粉为 15. Og/L, NaCl 为 1. Og/L, KH2P04 为 0. lgL,pH 值为 7.07.2o1） 3主要原材料和仪器设备1）原材料葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白脓，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。2）仪器设备发酵 摇瓶机（NewBrunswickSci ent if icInnova2300 ）,Eppendorf公司提供;ARTP-S等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提供;PIC021离心机，Thermo公司提供。2方法2） 1检测方法1）菌体浓度的检测采用PMV法（packedmassvolume）测定菌体生物量9。2）样品处理方法取发酵液1.0mL,用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10mL,浸泡6090min, 3000rmin离心10min后取上清液进样。3） HPLC检测色谱条件色谱柱(Symmetry Shi eldRP 18, 4. 6mm × 250mm, 5 m),流动相为乙庸-四氢吠喃-三乙胺水（pH值为3.2,体积分数为0. 2%）,三者体积比为7 ： 1 ： 92）,柱温为30,流速为1. 0mLmin,进样量为20uL,检测波长为280nm02.2培养方法1）斜面及平板培养取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单抱子悬液涂布于平板培养基，28七培养68d。2）种子培养挖取约0. 5cm2斜面袍子接入装有30mL种子培养基的三角瓶中，摇床转速为220rmin, 28培养24h。3）发酵培养种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220rmin, 28C培养6d放瓶。4） 50L罐培养采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0. 5%接种于10L种子培养基中，28C培养48h后以体积分数5%接种量转接于30L发酵培养基中，发酵过程中通气比为lm3（m3inT）,初始搅拌转速为350rmin,发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20% （体积分数）。发酵50h后用氨水控制pH值不低于7. 2, 28培养7d放罐。2. 3高产菌株选育2. 3. 1单抱子悬液的制备取生长良好的斜面2支，加入无菌水洗下袍子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120rmin振荡15min打散菌体，过滤后制备成约106个mL的单抱子悬液。2. 3. 2链霉素最低抑制浓度的确定取50 uL单抱子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，289培养68d。2. 3. 3复合诱变选育菌株1）紫外诱变取单抱子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30cm,紫外功率为30W）分别照射30, 40, 60, 80, 100s,稀释涂布于平板培养基中，28口培养68d。根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。2) ARTP诱变取单抱子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110W,工作气流量为10Lmin,射距离为2mm）,分别处理15, 30, 45, 60, 90s后，稀释涂布于平板培养基中，28培养6-8do根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80100个单菌落按照2. 2项的方法进行筛选，计算突变3）复合诱变根据确定的最佳条件紫外照射60s、ARTP诱变45s,采用复合诱变处理万古霉素单袍子悬液。2
