中检所老师解析HPLC校正因子法的应用.docx

中检所老师解析HP1C校正因子法的应用标准物质一直是药品质量控制特别是纯度和含量分析的首选，但标准物质的供需矛盾，如有些杂质标准物质不易获取以及多个标准物质同时使用所带来的高昂检测成本等限制了标准物质的实际应用。为解决这一问题，替代方法应运而生，高效液相色谱(HP1C)校正因子法便是其中之一。该方法最初主要用于HP1C有关物质检查时对于特定杂质的定量，进而又逐渐用于中药多指标含量的测定，发展至今已经成为一项成熟的分析方法。近年来，随着国内仿制药一致性评价的深入开展，有关物质作为药品的关键质量属性已成为被评价的重要内容之一，而在有关物质申报资料中缺少校正因子的研究是药品审评中心通知申请企业补充完善资料的一个主要原因，这使得校正因子的研究重回企业和科研单位的视线,成为被关注的焦点。目前，国内外有关校正因子在测定和应用方面鲜有详细的指导原则发表，因此本文综述了近年来国内外相关领域的研究进展，以期总结出校正因子在测定和应用方面的一些规律和存在的问题，给企业提供更多的参考依据。定义在HP1C法定量测定中，通常所讲的校正因子是某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即相对校正因子，其计算公式如公式(Do校正因子在各国药典中均有应用，只是表述方式不尽相同。中国药典与欧洲药典(EP1O.0)基本一致,使用校正因子(correCtionfactor)的概念,差别在于国内要求当已知杂质对主成分的相对校正因子在O.911内时，可以用主成分自身对照法计算杂质的含量,超出这个范围时宜用杂质对照品或者加校正因子的主成分自身对照法计算杂质的含量；而EP10.0中则规定校正因子在0.81.2时仍可使用主成分对照法计算杂质含量。美国药典(USP)中给出了相对响应因子(re1ativeresponsefactor)的概念，从其各论中具体计算方法可以推导出相对响应因子与相对校正因子是互为倒数的关系，在使用时需要注意将待测峰面积(A)与校正因子相乘或与相对响应因子相除以校正峰面积。rC待测物/"待测物/八f=(1)C参比物/"参比物c为待测物和参比物溶液浓度另外校正因子的使用也有一定的范围，如校正因子在0.25.0的范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物质(如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质)，重新确立校正因子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当方法定量。测定方法HP1C-UV/PDA方法单点法制备适当浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，按照公式1计算得到校正因子。该方法的优点是操作简单，但由于无法排除样品处理或者检测过程所引入的偶然误差，且没有考虑到样品浓度对测定结果的影响等因素，因此该方法主要用于预实验时粗略的估计实验结果，在校正因子定值时实际应用较少。多点法制备适当的高、中、低三水平浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液，如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度，分别注入液相色谱仪进样测定，按照公式1计算得到多个校正因子值，求取平均值作为校正因子。目前该测定方法在中药多指标对照品替代测定中应用较为广泛，但在杂质含量确定方面应用较少。标准曲线法目前，校正因子的测定最常用的方法还是标准曲线测定法。具体操作如下：精密称取待测物对照品和参比物对照品各适量，分别配制成不同浓度的系列溶液，如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度，分别注入液相色谱仪进样测定，以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，分别绘制参比物和待测物标准曲线A=kc+b,当b=0时，可以推导出两者的相对校正因子为二者斜率k之比，即公式（2）：参比物/%恃泅物（2）其中k分别为参比物和待测物标准曲线的斜率。联立方程法前述3种HP1C方法使用的前提就是待测物和参比物最好备有色谱纯的化学试剂或标准物质,即使没有色谱纯，也要确知物质的百分含量。但在药物研发的早期，很难得到己知杂质的纯品，因此，YU提出了一种无纯样色谱校正因子的测定方法。根据校正因子与峰面积成正比（校正因子是常数的条件）的前提，设一“标”样仅含A、B二组分且都出峰，各组分的量之和为一定值（如A、B两组分含量之和为100%）,因而可建立各组分的量之和与校正因子、峰面积三者之关联式，另一“标”样亦仅含A、B二组分，但峰面积有差异（即二组分含量有异），同样可建立三者关联式，解两个关联式即可得各组分校正因子。由此推论有几个组分就要建立相应个数的关联式求解而得到各组分的校正因子。该方法为早期检测研发中带有多个未知校正因子组分的样品提供了一个新的解决思路,但是受早期研发样品中可能还含有很多未知杂质等因素的限制，目前可以检索到该方法的实际应用较少。紫外吸光系数比值法结合文献，Xu等首次推导出了公式（3）,证明了两物质的相对校正因子是两者的百分吸光系数（E）之比。f=E特测物/E参比物（3）因此可按吸光系数测定的相关技术要求,如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸光度介于030.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备测定、同台仪器2份供试液的平行测定结果不超过±0.5%等，以流动相为溶剂，测定待测物和参比物在检测波长处的紫外吸收系数E1%1cm,计算比值，求得校正因子.HP1C联用其他方法HP1C-UV/PDA串联其他检测器方法为解决HP1C-UV/PDA检测器方法有时很难获得待测物和参比物标准物质的难题，有研究者提出通用型质量检测器技术与PDA或UV检测器串联以确定校正因子的方法。这种通用型质量检测器产生的峰面积与相应的进入检测器的分析物的量成正比关系，而与分析物的结构特性无关，从而可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系，再结合UV/PDA检测器得到的峰面积，由公式(1)可推导出待测物相对于参比物的校正因子，如公式(4)所示：IArZ1待测物UV峰面积，”待测物质R型检刑器峰面积/4、/=A/A(4)C参比物UV峰面积参比物质R型检测器峰面积在药物早期研发过程中使用此方法可以快速方便的测定特定杂质的相对响应因子,不需要进行杂质的分离纯化，也不需要杂质标准品，甚至可以不需要知道分析物的浓度。目前可与紫外检测器串联测定相对校正因子的通用型质量检测器主要有蒸发光散射检测器(E1SD)电喷雾检测器(CAD)、化学发光氮检测器(C1ND)、示差折光检测器(R1)等。其中E1SD.CAD,其检测的峰面积与进入检测器的分析物的质量成正比关系；C1ND检测的峰面积与分析物中含氮的摩尔数成正比关系。通过这些信息可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系，再结合紫外吸收检测器得到的待测物与参比物峰面积，可计算出特定杂质相对于参比物的校正因子。目前仅检索到国外的相关研究工作，未见国内相关报道。HP1C-UV/PDA检测器结合核磁定量方法虽然紫外检测器与通用型质量检测器串联的HP1C法在测定杂质相对校正因子时方便、快速，但这些通用型的质量检测器都各有局限性。如E1SD受精密度、线性动态范围、需要挥发性流动相等因素的局限，且E1SD的响应取决于探测器中发生的去溶剂化过程所产生的粒子的数量和性质；C1ND只能测定含氮化合物，但不能够测定结构中包含一N二N一和一NN结构的化合物，也不能够用含氮的流动相、流动相中不能有非挥发性的缓冲盐；CAD的流动相中也不能有非挥发性的缓冲盐，而且只适用于在电喷雾电离条件下能够携带电荷的化合物，R1受灵敏度、重现性等问题限制且不能用于梯度洗脱。NMR除具备检测器串联HP1C法的优点外，不受上述检测器的流动相、缓冲液等色谱条件的限制，q-1H-NMR检测的峰面积与分析物中相应的氢的摩尔数成正比关系，可以作为含有质子的化合物测定相对校正因子的通用质量型检测器,但前提是该化合物可溶解在合适的笊代溶剂中。于是Webster等建立了HP1C-UVq-1H-NMR结合的方法测定特定杂质的相对响应因子(RRF)的方法。IH-NMR检测的峰面积与分析物中相应的氢的摩尔数成正比关系，所以相对响应因子的计算公式如下：/uvznmrMNHRRFUV=侍测物*/参比物X'.参比物X-测物。f-/NMRAfH-“参比物待测物'"r待测物ZV参比物其中AUV为紫外检测器的相应峰面积；INMR为NMR谱图中相应氢的积分值；Mr为相对分子质量；NH为化合物结构中用于积分计算的相应的氢的个数。应用在有关物质含量测定中的应用高效液相色谱法是目前药品有关物质检查最常规的手段,使用高效液相色谱进行杂质含量测定仍首推外标法，但该方法常常受到杂质标准物质获得和供应困难等因素的制约。加校正因子的主成分自身对照法由于在日常检验中省去了杂质标准物质，又同时考虑了杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差，准确度较好，目前己被广泛应用。中国药典自2000年版在高效液相色谱法通则中增加了“加校正因子的主成分自身对照法”，同时各国药典各论也在逐渐采用该方法替代简单的主成分自身对照法，如欧洲药典(EP1o.0)和中国药典(2015年版)均采用了加校正因子的主成分自身对照法检测环丙沙星杂质B、C、D、E的含量。目前对于校正因子在有关物质检查中的应用研究大致可以分为两类。第一类是测定特定药品杂质相对于主成分的校正因子，以完善主成分的质量标准。如Zhao等采用自建的标准曲线法测定了注射用头也孟多酯钠中杂质A、C、D和E相对于头施孟多酯的校正因子；Qi等建立了加校正因子的主成分自身对照法测定吉非替尼原料药中有关物质的含量，其中采用标准曲线法测定了杂质SM1、I、XV、SM2、X1kD和C相对于吉非替尼的校正因子；GUo等建立了HP1C加校正因子的主成分自身对照法同时测定琥珀酸索利那新原料药中7种有关物质的方法,其中采用标准曲线法测定了7种有关物质相对于琥珀酸索利的校正因子。从查阅的这些校正因子测定的文献来看，目前校正因子的测定方法主要集中在标准曲线法。仅个别研究采用了多点法进行校正因子的测定，如Yan等配制了低、中、高3个浓度水平的对照品溶液，每个浓度平行制备3份样品分别进样分析，以均值作为有关物质A、B、C、D相对埃索美拉嚏镁的校正因子,建立了加校正因子的主成分自身对照法测定埃索美拉唾镁原料药中有关物质含量的HP1C法。另一类则是针对目前校正因子在测定和使用方面的不足,对方法进行改进或者开发新的方法。如针对存在多个杂质的药品使用校正因子方法时可能存在杂质定位困难的问题，Chen提出应用定向降解主成分得到相应杂质进行定位,再采用加校正因子的主成分自身对照法对该杂质进行定量的方法。针对在药物研发的早期，很难得到己知杂质的纯品用于校正因子测定的问题，Yu提出采用联立方程组的方法测定无纯样色谱校正因子，也有人尝试两种检测器串联的HP1C法以解决这一难题，如Hong等建立了高效液相色谱法紫外检测器与蒸发光散射检测器串联(HP1e-USE1SD)的方法测定格列美服中有关物质B和C的相对响应因子；Sun等采用紫外检测器和电喷雾检测器串联的高效液相色谱法(HP1C-UV-CAD)测定紫杉醇中8种有关物质的相对响应因子；Nuss-baum等建立了紫外检测器和化学发光氮检测器串联的高效液相色谱法(HP1C-UV-C1ND)测定特定杂质的相对响应因子。针对上述质量型检测器与紫外检测器串联测定校正因子的一些局限性，HP1C-UV与q1H-NMR结合的方法测定特定杂质的相对响