线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书.docx

线粒体复合体In试剂盒说明书微法IOO管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：线粒体复合体In（EC1.10.2.2）又称COQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C。渊定原理：与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在55Onm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体In酶活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：试剂一：液体IoOm1X1瓶，20保存；试剂二：液体20m1x1瓶，-2OtC保存：试剂三：液体1.5m1×1支，20C保存；试剂四：液体20m1x1瓶，49保存；试剂五：粉剂X1支，209保存；试剂六：液体2.5m1x1瓶，20C保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入Im1试剂一和IOU1试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,4*C离心5min。3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmin。4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体In（此步可选做5、步骤中的沉淀即为线粒体，加入200U1试剂二和2u1试剂三,超声波破碎（冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次），用于复合体III酶活性测定。渊定步骤：1、分光光度计或函标仪预热30min以上，调节波长至550nm,蒸储水调零。2、样本测定（1）工作液的配制：将试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37*C（哺乳动物）或25C（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20*C保存，禁止反匏冻融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入101样本、251试剂六和2001工作液，立即混匀，记录55Onm处初始吸光值AI和2min后的吸光值A2,计穿AA=A2-A1短合体H1活力单位的计算：a.使用微量石英比色斯定的计算公式如下：（1）按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InmoI还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体HI活力（nmo1/minmgproi）=AAV反总÷（×d）x104÷（CprxV样）÷T=615AA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2）按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟催化产生Inmo1还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体HI活力（nmo1/min/g鲜重尸AAxV反总÷（×d）x104÷（WxV样÷V样总）÷T=124AA+W（3）按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生Inmo1还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体HI活力（nmo1min"ce11）=A×V反总÷（×d）×109÷（500×V样÷V样总）÷T=0.248×AV反总：反应体系总体积，2.35x1O11;£：细胞色素C摩尔消光系数，1.91x1041mo"cm;<1：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。b.使用96孔板渊定的计算公式如下：（1）按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmo1还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。竟合体III活力（nmo1/min/mgproi）=AAV反总÷（×d）×109÷（V样XCPr）÷T=123（hAA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2）按样本鲜重计算单位的定义：卷g组织每分钟催化产生Inmo1还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。梵合体III活力（nmo1/min/g鲜重尸AA'V反总÷（×d）x104÷（WV样÷V样总）÷T=248AA÷W（3）按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生Inmo1还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体In活力（nmo1min104ce11）=A×V反总÷（CXd）×109÷（500×V样÷V样总）÷T=0.496×AV反总：反应体系总体积，2.35x10,1；:细胞色素C摩尔消光系数，1.911041mo"cm;d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。