线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书.docx

线粒体复合体试剂盒说明书微法IOO管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：线粒体复合体II又称琥珀酸辅酶Q还原醉，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADHa后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。渊定原理：复合体II的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,&二氯阿味酚，2,6.二氯口引噪酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6.二氯口引味酚的减少速率来计算该酶活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂组成和配制：试剂一：液体IoOm1X1瓶，20保存；试剂二：液体20m1x1瓶，-2OtC保存：试剂三：液体1.5m1×1支，20C保存；试剂四：液体25m1x1瓶，49保存；试剂五：粉剂X1支，209保存；试剂六：液体2.5m1x1瓶，4保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入Im1试剂一和IOU1试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,4*C离心5min。3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmin。4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体H（此步可选做5、步骤中的沉淀即为线粒体，加入200U1试剂二和2u1试剂三,超声波破碎（冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次），用于复合体II酶活性测定。渊定步骤：1、分光光度计或函标仪预热30min以上，调节波长至6O5nm,蒸储水调零。2、样本测定（1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37tC（哺乳动物）或25*C（其它物种）孵育5min;用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入101样本、251试剂六和2001工作液，立即混匀，记录605nm处初始吸光值AI和2min后的吸光值A2,计算AA=A1-A2。短合体II活力单位的计算：H.使用微石英比色JO1定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋H每分钟消耗1nmo12,6.二氯口引睬酚定义为一个醉活力单位。复合体II活力(nmo1/minmgproi)=A×V反总÷(×d)×109÷(V样XCPr)÷T=559×A÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo12,6.二氯呻噪酚定义为一个酶活力单位。复合体活力(nmo1/min/g鲜重)=AAV反总÷(×d)x104÷(WxV样÷V样总)÷T=H3A-W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo12.6.二氯口引味酚定义为一个酶活力单位。复合体活力(nmo1min"ce11)=A×V反总÷(×d)×109÷(500×V样÷V样总)÷T=0.226×AV反总：反应体系总体积，2.35×i41;e：2,6二期引咻酚摩尔消光系数，2.1×IO41/mo1/cm：<1：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体枳，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。b.使用96孔板渊定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋H每分钟消耗1nmo12,6.二氯口引睬酚定义为一个醉活力单位。竟合体活力(nmo1/min/mgproi)=AAV反总÷(×d)×109÷(Cpr×V样)÷T=1118AA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：银g组织每分钟消耗1nmo12,6.二氯用噪酚定义为一个酶活力单位。梵合体活力(nmo1/min/g鲜重尸AA'V反总÷(×d)×109÷(W×V÷V)÷T=226×A÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo12,6.二氯吧咪酚定义为一个酶活力单位。复合体活力(nmo1min104ce11)=A×V反总÷(CXd)×109÷(500×V样÷V样总)÷T=0.452×AV反总：反应体系总体积，2.35×1O41;:2,6二期引噪酚摩尔消光系数，2.1×1041/mo1/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体枳，0.202m1：T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。