重组抗体药物的质量控制.docx

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1、抗体药物是生物工程关键技术的前沿成果，在肿瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病的治疗中均取得了显著疗效，在生物技术药物市场中的比重也在迅速攀升。作为生物技术产业化领域最成功的产品之一，如何通过质量控制确保抗体药物的安全有效一直是本领域的关注热点。文中就重组抗体药物质量控制的关键环节、进展及未来需要进一步开展的工作作一简要综述。药品的质量源于设计，而非依赖终产品的检测，重组抗体药物也不例外。广义的质量控制包括生产过程控制、终产品质量控制等环节。抗体由两条重链和轻链以链间二硫键形成连接，结构复杂、相对分子质量大，采用哺乳动物细胞表达体系制备通常含有翻译后修饰，与原核体系制备的生物技术产品相比，其质量

2、控制难度相对较大。重组抗体药物的生产过程包括工程细胞的构建及传代扩增、细胞培养、抗体的纯化、产品分装保存等。因此生产单位需遵循药品生产质量管理规范(GMP)的总体要求建立质量体系，并通过质量保证部门对生产过程实施全程监控才能确保终产品的安全有效。鉴于抗体药物生产过程与其他生物技术药物类似，本文未对抗体药物生产的过程控制进行阐述(相关内容可参见国家食品药品监督法规与ICH指导原则等)，而主要侧重于介绍重组抗体药物生产细胞、质控用标准物质、产品质量控制方面的研究进展。Part1、生产细胞的质量控制重组单抗的生产细胞应来自于共同的原始细胞，具有相同的遗传和生物学特征，经全面检测无病源微生物污染，在特

3、定的培养条件下，可以稳定持续地表达结构正确并具有生物学活性的抗体。1工程细胞的构首先应清楚所采用细胞系的来源及培养历史等有关背景资料，包括细胞种属及地域来源、病原体检测结果、最初分离培养和建系信息、采用的方法与原材料等。在构建中应说明构建和筛选的手段与步骤、克隆基因的序列、插入载体目的基因编码区和相关侧翼序列，说明载体引入细胞的方法及载体在细胞内的状态与拷贝数，并应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。同时还应明确细胞的生长特征、培养条件、培养液组成、导入目的基因的表达水平等。2细胞库的建立细胞库的建立可为重组抗体药物提供质量稳定以及能持续传代的细胞种子，从而确保抗体药物生产的批间一致。与其他

4、生物技术药物的要求类似，抗体生产的细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。原始细胞库是由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体或经过克隆选择而形成的均一细胞群体。主细胞库、工作细胞库则分别由原始细胞库和主细胞库经传代后均匀混合而成。其中主细胞库最多不得超过2个细胞代次，同时限定工作细胞库代次。工作库冻存时细胞的传代水平须确保复苏后传代增殖的细胞量能满足生产一批制品。复苏后细胞的传代水平不应超过批准用于生产的最高限定代次。细胞库的管理要求建立台账，每支细胞有明确标记，包括名称、代次、批号、冻存日期等。主库和工作库应分别存放，非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。上述各级种子库的

5、细胞应按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用。3细胞检定抗体药物的生产细胞检定包括鉴别、病源微生物、致瘤性等检查，同时以基因工程技术构建的重组抗体生产细胞，还应包括特异的鉴别试验与细胞基质稳定性内容。细胞鉴别细胞鉴别可通过形态、生化方法（同工酶等）、免疫学检测（组织相容性抗原等）、遗传学检测（染色体核型等）、遗传标志检测（DNA指纹图谱等）等方法，并应采用不同方法进行联合检测。抗体基因或其表达产物可通过PCR,限制性内切酶谱、Southern杂交以及免疫印迹等方法进行鉴别。建库后应对主库和生产终末细胞进行全检，同时新建的工作库细胞也需按规定要求进行检定。病源微生物检测该项检测包括无菌、支原体

6、、细胞内、外源病毒因子检查。其中病毒检测的种类及方法须根据细胞的种属来源及细胞特性决定。通常病毒因子可通过细胞形态观察、红细胞吸附试验、不同细胞传代培养法及接种动物和鸡胚法检测，其中，中华人民共和国药典2010年版三部中新增规定：用不同细胞传代培养法检测病毒因子时，应设立可观察细胞病变的病毒阳性对照及血吸附阳性对照。对于重组工程细胞来说，还应当对细胞裂解物或收获液进行外源因子检。对于逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测，可采用逆转录酶活性测定、透射电镜以及感染性试验方法。根据待检细胞系的种属及组织来源，还应进行特殊外源病毒因子的检测。如鼠源细胞系，需检测出血热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病

7、彘、呼肠孤病毒等；如为人源细胞系，应检测鼻咽癌病毒、巨细胞病毒、乙型、丙型肝炎病毒等。致瘤性检查致瘤性检查可通过裸鼠和新生小鼠体内试验以及软琼脂克隆形成等体外方法进行。目前重组抗体生产的CHO等细胞株己证明具有致瘤性，通常不再要求进行该项检查，但也有观点认为插入抗体等特定基因序列的重组工程细胞应当被视为全新细胞，须进行致瘤性检查，并在传代/扩增过程中进行试验对比，观察致瘤性特征的改变。基于安全性考虑，还需要优化抗体药物的纯化工艺，并在终产品的放行中严格限量控制残余DNA等具有潜在致瘤性风险的组分。细胞基质的稳定性作为经DNA重组技术获得的含有特定基因序列的重组抗体生产细胞，生产者还须具有细胞基

8、质的稳定性资料，包括重组细胞的遗传稳定性、目的基因表达稳定性、目标产品持续生产的稳定性，以及在保存时细胞生产抗体产品能力的稳定性等资料。Part2、质量控制标准物质标准物质和检测方法是抗体药物质量控制的两个重要技术支撑点，而性质稳定均一的标准物质是方法学建立中必不可少的重要因素。包括抗体在内的生物大分子的结构决定其功能，因此其质控标准物质也包括理化对照品及活性标准品。1标准物质的制备标准物质的均一、稳定至关重要。因此原料需进行全面的质量分析，甚至在部分关健质控项目上的标准应高于产品。原料的选择应遵循与供试品相同的原则，其配方研究要在基于不干扰测定结果的前提下，尽可能提高稳定性。理化对照品在经过

9、全面的分析和鉴定后，主要在常规质控中用于结构和翻译后修饰的确证。活性标准品则通过协作标定进行赋值。安甑分装冻干后熔封的制备方式因其良好的气密性是标准物质制备的首选。标准品的分装应在洁净环境下进行，在保持条件一致的前提下，于分装前、中、后阶段以相同时间间隔抽样进行分装精度控制(1.0%),冻干后还应进行无菌、水分等检测，通常标准物质的残留水分应3.0%,但该指标与稳定性相关，因此应尽量降低标准物质中水分的残留量,抗体质控标准物质一般进行冷藏或低温冷冻保存，其有效期需根据稳定性评价确定。稳定性研究包括热加速试验、期间核查及长期稳定性试验。热加速试验是通过在不同温度条件下加速样品的化学降解或物理变化

10、，通过热动力学参数与数学模型分析预测标准物质在既定储存温度下的活性、含量变化。长期试验则是指在既定的保存条件下进行的实时稳定性监测。为反映出标准物质稳定性特征的全貌,应设定多个指标进行评价，如效价、纯度、含量等。2理化对照品正确的结构是重组抗体发挥其生物学功能的基础。理化对照品不仅是建立抗体药物质控标准的前提和基础，而且还可简化常规质控方法，无需涉及质谱等大型分析仪器，通过产品与理化对照的比对分析，即可发现产品结构是否存在异常。理化对照品结构的全面鉴定一般包括质谱相对分子质量测定、末端氨基酸序列测定、液质肽图或肽指纹图谱分析、二硫键配对方式以及代表翻译后修饰的糖基化分析等。质谱相对分子质量测定

11、抗体由4条肽链组成，且Fc段具有糖基化修饰，可直接测定完整抗体的相对分子质量，也可以用糖昔酶切除糖基后再测定抗体蛋白部分的相对分子质量，或者以还原剂将二硫键打开后分别测定抗体轻、重链相对分子质量。目前质谱相对分子质量测定主要采用电喷雾离子化(e1ectrosprayionization,ES1)及基质辅助激光解析离子化(matrix-assisted1a-serdesorptionionization,MA1DI)等离子源。蛋白离子化后，通过质量分析器测定其质荷比计算相对分子质量，并与理论相对分子质量进行比较，以初步验证抗体结构是否正常。末端氨基酸序列测定末端氨基酸序列测定也是抗体一级结构鉴定

12、的方式之一。通常N-末端氨基酸测定以Edman降解法最为常用。由于抗体的特殊结构，测序时须首先将二硫键还原，并以适当的方法将轻、重链分离后再测定。如果抗体的N-末端存在封闭，则需针对封闭类型，采用相应方法去封闭后再按上述程序进行测定。常见封闭形式及去封闭方法见表U表1常见N-末端封闭形式及去封闭方法封闭基团修饰残基去封闭方法甲酰基甘获酸、蛋氨酸酸水解,崩解乙酰基丝冢酸、内品酸、蛋亚酸、甘氨酸、酸水解,肿解谷叔酸、苏树酸、缎短酸、帏代酸焦谷获酰谷获酸、谷叔酰胺焦谷氨肽酶水解目前C-末端氨基酸序列测定可采用酶法或化学法收集C-末端肽后，再以、-末端测序方法进行；也可以直接对收集的C-末端肽段进行串

13、联质谱分析。此外，还可通过质谱仪测定被痰肽酶酶解后获得的C-末端长短不一肽段的相对分子质量，并根据相邻相对分子质量的差值确定C-末端序列。液质肽图或肽质量指纹图谱分析为了进一步鉴定重组抗体的一级结构，可进行液质肽图或肽质量指纹图谱分析。液质肽图是将抗体用蛋白酶酶解为肽段后，先经色谱分离后再以质谱检测，通过相对分子质量测定结果与蛋白酶酶解特性的综合分析来确定各肽段的序列。而将酶解所得肽段直接进行质谱检测则称为肽质量指纹图谱。液质肽图的优势在于各肽段经过液相分离后，在质谱相对分子质量测定时相互之间的干扰较弱，但耗时较长；而后者则适宜高通量分析。二硫键分析IgG1型抗体中，共有16条二硫键，正确配对

14、的链内、链间二硫键是维持重组抗体空间结构和发挥生物学功能的重要保障。二硫键的确定方式可采用液质肽图或肽质量指纹图谱法。即在非还原条件下，将重组抗体直接进行蛋白酶酶切，酶切后有些肽段仍通过二硫键连接在一起，通过对这些肽段进行质谱鉴定即可验证抗体的二硫键配对方式。为确保抗体的完全酶解，必要时可分别采用两种或以上的蛋白酶进行酶切，并通过综合分析对抗体二硫键配对的方式进行鉴定。糖基化分析糖链在维持抗体正常结构及与其他蛋白的相互作用中均发挥了重要作用，抗体Fc段的糖链改造可显著改变其生物学活性。因此在抗体的质量控制中，翻译后糖基化修饰的分析是十分必要的。目前主要包括寡糖图谱、糖基化位点分析及糖链结构分析

15、等。寡糖图谱是对重组抗体药物中不同修饰形式的寡糖链所占比例的分析。即将糖甘酶从抗体上切下的糖链衍生、纯化后，再以液相色谱分析确定各寡糖链所占的比例。寡糖多样性形式的进一步分析，可结合文献资料并采用相应的寡糖参考品进行综合比对。抗体的糖基化主要有N-糖与O-糖两种，位于糖还原端的N-乙酰葡糖胺（GICNAC）与抗体中的天冬酰胺（ASn）的酰胺氮以B1,4糖首键相连，且糖基化位点处有特殊的序列子结构“Asn-X-Ser/Thr”，其中“X”为除脯氨酸（PrO）外的任意氨基酸，只有该序列子中的Asn才有可能发生N-糖基化。0-糖虽无特殊序列子结构，但可与抗体中丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）的羟基

16、相连。糖基化位点可通过切除糖链前、后的液质肽图或肽质量指纹图谱的方法确定，通过对图谱中相对分子质量的差异肽段进行分析，即可确定糖基化位点。糖链结构分析目前有多种方法：可通过测定糖链的相对分子质量结合己有的文献资料对糖链结构进行预测；也可通过串联质谱的方法测定糖链结构;或结合多种糖苗酶对糖链进行分步酶切测定单糖的连接方式等。3生物学活性测定标准活性测定是抗体质量控制的重要环节。生物学活性测定标准品同样需要遵从材料均匀、性质稳定的要求，同时还需要进行准确的赋值。重组抗体质控用活性标准品的制备、稳定性评价同上所述。通常其冻干制备过程中需要添加稳定剂或赋形剂等辅料，但可通过提高活性成分的分装量，并在梯度稀释进行活性测定前，以提高预稀释倍数的方式将辅料对活性测定的干扰降至最低。虽然目前大多数抗体生物学活性测定是通过供试品与活性标准品