2023流式细胞术的临床应用专家共识（完整版）.docx

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1、2023流式细胞术的临床应用专家共识(完整版)流式细胞术在临床血液及免疫相关疾病的精准诊治中具有重要作用。随着流式细胞仪普及程度的不断提高，临床实验室开展流式细胞术检测，服务临床诊疗的能力和水平也逐渐提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和需求，加强质量控制，结合近年来国内外相关领域研究进展，对2013年发表的流式细胞术的临床应用共识进行更新，制定此共识。随着医学的进步及疾病精准化诊治需求的增加，我国临床实验室流式细胞仪的普及水平得到提高，开展流式细胞术检测服务临床诊疗的能力和水平亦不断提升。为适应流式细胞术临床应用的进展和临床检验需求的更新，我们延续2013年流式细胞术临床应用的建议【1】的编

2、写初衷，并在此前版本的基础上，经专家组讨论，适时对相应内容进行修订和扩增。本共识由国家医学检验临床医学研究中心、中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委临床检验中心及中华检验医学杂志编委会组织专家进行讨论撰写并发布。一、流式细胞仪及器材的准备(-)流式细胞仪的选择2017年12月，我国颁布流式细胞仪国家行业标准2,规定了流式细胞仪的产品分类、技术要求、试验方法及使用方法等。在临床检验工作中，应选择有临床注册证的流式细胞仪，满足检测灵敏度和收集速率等的要求；根据检测项目所需参数，确定适宜激光器和检测器，使其检测参数与临床使用的荧光抗体匹配；考虑操作的简便性和兼容性，以及未来可升级满足新检测需求的空

3、间；兼顾临床实验室场地、仪器维护、人员培训、试剂和耗材供应稳定性、售后服务等因素。（二）流式细胞仪的设置1 .仪器质控：流式细胞仪的仪器性能与检测结果准确与否密切相关。为保证仪器运转正常，每日开机流程后应运行仪器的质控微球等，保证仪器处于最佳性能状态，变异系数小于仪器软件中的可接受范围。如有可接受范围外的偏离，应及时进行校准和维修。2 .仪器维护:（1）环境温湿度可影响激光器、光纤和棱镜等光学元件，使用时可参考仪器说明书推荐的温湿度，推荐室温1825;（2）灰尘可损伤激光器和光学元件，降低检测的灵敏度，日常工作中注意仪器的整洁，清洁频率依据环境而定；（3）使用1%的次氯酸或75%医用乙醇每日清

4、洁进样针，宜定期（或按需）清洁流动室，避免黏性大和聚集成团的细胞堵塞进样针；（4）过滤器影响荧光信号的稳定性和压缩空气的供应，在需要时排除气泡并定期更换；（5）鞘液桶、废液桶需维持密闭性，定期清洁和更换；（6）电脑数据定期备份，存储数据不超过硬盘的一定容量，避免损坏和拖慢系统性能；（7）定期对仪器性能进行全面评估、校准和保养，并应出具书面报告。3.补偿设置：传统的多色流式细胞仪存在荧光溢漏，合适的补偿是获得可靠数据的关键3,4,5。（1）补偿对照可以使用新鲜血细胞制品（更贴近待检测细胞）和商品化的荧光微球（操作简便）。使用荧光微球建立的补偿，宜用待检细胞进行优化；（2）如流式细胞仪具备自动补偿

5、”功能，可采用自动补偿进行条件设置并进一步手动优化；（3）同一通道检测的相似荧光,建立补偿时不能互相替代,如PE-Cy5、PerCP.PerCP-Cy5.5等,应分别建立补偿;（4）补偿设置的染色处理过程宜与待测项目一致，细胞膜染色和经过固定、破膜的胞浆（或胞核）染色会有不同，建议分别设置补偿；（5）补偿矩阵并非永久适用，当建立新的实验或仪器性能出现允许范围外的变化，应重新建立补偿。（三）移液器、离心机、标本前处理系统等的维护及定期校准上述仪器除日常清洁维护，应按照实验室认可标准（例如ISO15189）的相关要求，定期对不同量程的移液器、离心机和标本前处理系统的性能进行全面评估和校准，并出具书

6、面报告。共识1临床检测选用的流式细胞仪应有国家有关机构核发的注册证。建议根据临床实验室及流式细胞术检测项目的特点，选择技术性能符合使用要求的流式细胞仪，宜同时考虑相关技术培训及售后服务等。流式细胞仪的使用应注意每次检测过程中的仪器质量控制，应按要求进行维护保养和校准评估。流式细胞术检测相关的器材也应注意日常清洁维护和定期校准评估。推荐强度：强烈建议。二、流式细胞术检测试剂(-)荧光抗体的选择和搭配流式细胞术使用的抗体应符合国家相关标准6。在搭配多色抗体组合时需要考虑5:(1)流式细胞仪的检测通道特性：根据流式细胞仪的配置，选择可使用的荧光抗体；(2)荧光染料本身的强弱、荧光标记物的稳定性、荧光

7、素分子大小、荧光抗体克隆号等，例如同一荧光标记物，不同克隆号抗体对某些抗原的检测效果也会出现差异7,8;(3)待测抗原表达强弱：弱表达抗原选择强荧光标记，强表达抗原可选择弱荧光标记；(4)尽量避免光谱重叠多的荧光染料搭配如PE-Cy5和APC等，对细胞共表达的抗原进行染色时，尽量避免选用串色和荧光溢漏大的通道5。(二)抗体的滴定设置通过抗体滴定计算染色指数(stainindex,SI),判断荧光染色后阴性群和阳性群的分离效果，是确定最佳抗体使用浓度的重要方法。SI计算公式为:中位荧光强度(medianf1uorescentintensity,MdFI)阳性群-MdF1阴性群/(2rSD阴性群)

8、5S1受荧光强度、抗原表达强度、抗体结合力及流式细胞仪设置等影响5。在更换抗体或抗体批号之前，宜进行抗体滴定以确定最佳浓度，避免因抗体浓度不合适，导致弱表达抗原检测不到或强抗原超出检测限。(三)对照的设置和选择选择适宜的对照是流式细胞术检测中正确获取和分析数据的基础5o荧光减一fu11ystainedminusonef1uorochromeSEfIuorescenceminusone,FMO）对照是目前确定阴性和阳性细胞群CUtOff值的最佳对照，对于弱阳性或阳性细胞比较少的情况尤为适用，可排除交叉干扰等；同型对照可评估Fc受体或蛋白的交叉反应，排除非特异性染色。生物品对照如血液制品质控，可根

9、据制品的CUtoff值来确定检测样品的阴阳性。（四）其他试剂红细胞裂解是流式细胞术检测血液白细胞或骨髓有核细胞时不可或缺的过程9,10,宜选择相应品牌的裂解液或自行配制。由于裂解液可对粒细胞和单核细胞等造成不同的影响，也会影响染色的效果9,10,建议根据检测目的不同进行比对，择优选用。细胞的稀释、洗涤和重悬需使用缓冲液或稀释液11,12,13,宜依据反应的最适PH值（如中性）、副作用（如磷酸盐缓冲液会导致一些激酶反应的抑制）、可能的络合作用、对光谱的吸收以及成本等进行选择13日常工作中可选用商品化的缓冲液或PBS,依据检测目的确定是否添加胎牛血清/牛血清白蛋白，以及是否加入叠氮化钠用于保存。此

10、外，细胞培养基和医用生理盐水等也可用作稀释液和缓冲液。不同于细胞表面（细胞膜）的染色，对细胞内（细胞浆或细胞核）的分子进行染色，需要经过固定（如甲醛等），保持目标抗原的位点和结构，再通过破膜（如Triton-X）使抗体进入细胞。不同品牌破膜剂对细胞内染色有不同程度的影响，建议根据检测效果进行比对，择优选用14。共识2流式细胞术检测中，建议合理选择和搭配所需荧光抗体，通过滴定确定抗体使用的最佳浓度，并合理选择和设置对照；染色过程中，选择适宜的红细胞裂解液、缓冲液以及固定破膜剂。推荐强度：强烈建议。三、标本的采集、存储、运输及制备（一）外周血标本（1）患者准备：流式细胞术检测同其他项目外周血采集无

11、异，因脂血等会对检测结果造成影响，采血前尽量清淡饮食；（2）抗凝剂选择：同时进行白细胞分类和流式细胞术检测时，建议使用乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝真空管进行标本采集，室温保存，尽快送检15。如进行T细胞功能的检测如IFN-Y分泌时，因EDTA可螯合钙离子，影响T细胞激活效果，建议采用肝素钠等抗凝。（二）其他标本骨髓标本、造血干细胞采集物的抗凝剂选择可以参照外周血。脑脊液标本一般不需要抗凝剂，渗出液性质的浆膜腔积液常有凝块，建议抗凝处理。因体液标本久置会导致细胞破裂，影响细胞计数、分类等检测结果，所以需要尽快送检。一般要求在采集后立即送检16,如使用特殊保存剂，可以适当延长送检时间17o样品应

12、离心浓缩调整细胞浓度后进行染色。对于淋巴结等组织标本，一般不需要抗凝剂，活检取材后应尽快送检。标本可经过物理研磨法和酶消化法获得单细胞悬液，调整细胞浓度后进行细胞染色。体外培养的细胞（如胞内细胞因子染色时，需刺激后加入蛋白转运抑制剂），根据细胞储存状态（冻存与否）、细胞特性（贴壁或悬浮），进行复苏或消化、洗涤，调整细胞浓度后染色。（三）标本制备流式细胞术标本的制备，需考虑新鲜度和检测项目的要求。（1）细胞浓度：一般不建议超过1106ce11s/m1（参照试剂说明书）；（2）全血体积：一般建议50-400118;（3）活细胞染料：常规新鲜外周血可以不使用活细胞染料，但造血干细胞计数、白血病微小残

13、留病（minima1residua1disease,MRD）筛选与监测等,建议添加活细胞染料如7-AAD等，以去除死细胞的干扰；（4）细胞染色、固定与破膜：需考虑细胞膜染色、细胞浆染色和细胞核染色的区别，选择相应适宜的固定破膜剂；（5）染色温度：一般室温染色即可18,但造血干细胞染色、使用某些固定破膜剂时,要求在融冰或4。（:完成；一些特殊项目（如中性粒细胞吞噬二氢罗丹明辅助诊断慢性肉芽肿）需经过37P孵育；（6）染色时间：受荧光抗体和染色体积影响，一般建议1030min18。根据目的抗原的位置分布不同（细胞膜、细胞浆和细胞核），染色时间不同，可依据说明书及检测需求，探索最优染色时间。另外，如

14、染色体积在2001以上，可适当延长抗体孵育时间18。共识3建议根据检测标本的种类及实验需求的差异，选择适宜的抗凝剂，采样后应尽快送检；样品制备时确保细胞浓度在合理的范围内，根据检测项目的特性，选择最优的染色方法和染色条件。推荐强度：建议执行。四、流式细胞术的临床应用（-）淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析是目前流式细胞术临床应用范围最广泛的项目，可获得淋巴细胞亚群包括CD3+总T细胞、CD3+CD4+辅助T细胞（Th）、CD3+CD8+细胞毒ftT细胞（Tc）、CD3-CD19+B淋巴细胞和CD3-（CD16CD56）+NK细胞的相对百分比（）和细胞绝对值（Ce1Is/）,在临床诊治中发挥了重要

15、作用。国家卫生健康委员会发布的流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南19（该行标处于修订过程中），以及流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用共识（2019版）20和TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识21等，对此项目的开展及应用具有重要的指导意义。（二）免疫细胞精细分型1 .淋巴细胞：（1）T细胞：对T细胞的精细分型，根据细胞表面标记区分T细胞，如调节性T细胞（Treg）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、Th1、Th2、Th9、Th17和Th2222初始（naive）、效应（effector）、效应记忆型（effectormemory）和中央记忆型（centra1memory）亚

16、群、活化细胞亚群等22,23,24,25（2）B细胞:根据CD27、IgDxCD24、CD38、CD5等表达，可以将B细胞分为不同亚群23,26,27,28,29。（3）NK细胞：根据CD16和CD56表达的不同，可以将NK细胞细分为不同亚群23,30,31目前精细分型的方案并未统一，表1汇总了文献报道的常见淋巴细胞精细分型方案，可供参考。2 .髓系细胞：（1）粒细胞:根据CD45和SSC,CD13和CD16以及CD66、CDI23、CD203cxH1A-DR等的表达不同，可以将粒细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞23,30。（2）单核细胞：根据CD45和SSC,CD13、CD14和CD16的表达不同，可以将单核细胞分为不同亚群