实验方法总结(2)：细胞实验部分.docx

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1、实验方法总结(2):细胞生物学部分1.1 胚胎干细胞诱导分化31.2 肿瘤干细胞(CSC)分离鉴定43 .细胞增殖相关研究方法73.1 MTT分析法732XTT73.4 CCK-8(WST-8)93.5 平板克隆形成93.6 软琼脂克隆形成103.7 BrdU114 .细胞转移相关研究方法114.2 细胞粘附124.3 Transwe11134.4 Transwe11侵袭146 .细胞周期：P1染色157 .细胞凋亡检测167.1 AnneinVPI双染色法167.3线粒体膜电位(MMP)检测189.血胞转染2010细胞慢病毒感染211 .原代细胞分离与培养1.1 原代细胞分离人或动物体内（或

2、胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。第一，悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采用1000rmin的低速离心10min。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。第二，实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。而消化分离法是指把组织

3、剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。1.2 原代细胞培养原代细胞的培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。第一，组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。第二，消化

4、培养法第三，悬浮细胞培养法。对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种第四，器官培养。器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。2 .干细胞分离培养2.1 胚胎干细胞诱导分化首先将类胚体消化成单细胞，贴壁培养，于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细

5、胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱导法。化学试剂诱导法：维甲酸(RA)、DMS0、-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2,5-羟基维生素D3等化学试剂，都能诱导ES细胞定向分化为特定类型细胞。细胞因子诱导法：

6、ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。增加或减少一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPS)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。外源基因诱导法：转基因法可以弥补细胞因子法的不足。其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达，从而调控ES细胞的分化。应用此方法之前，首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因,其次还要确保在适宜的时间将此基因正确插入到ES细胞基因组序列上。2.2 肿瘤干细胞(CSC)分离鉴定对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方法：第一类：依赖于细胞表面标志的分离方法造血系统肿瘤干

7、细胞：正常造血干细胞的表型为CD34CD38+Thy-1-实体瘤肿瘤干细胞：A.乳腺癌：ESA+CD44+CD241ow1ineage-的细胞是学IJ腺癌CSC。B.脑肿瘤:将CD133+的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞（BTSe）,还表达SoX2、Musashi-1,bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的基因特征C.结直肠癌：CD133+细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。上皮细胞黏附分子、CD44、CD166可以作为鉴定结直肠癌干细胞的细胞表面标志。以乳腺癌为例，介绍实验方法（其他肿瘤针对下面蓝色的关键词更改）：人乳腺肿瘤细胞分离培养：选择XXX医院肿瘤外科接受治疗的乳腺癌患者，经

8、过患者及其家属知情同意，在手术室无菌条件下获取肿瘤组织样本约IOg,置无菌组织转移液中，迅速转入无菌实验室内，PBS漂洗数遍，去除脂肪及坏死部分，将乳腺组织充分剪碎；将上述乳腺肿瘤组织移入离心管，加入8m1组织消化液（含2700Um1IV型胶原酶1m1、0.02mgm1透明质酸酶1001DNase501的DMEM培养液），轻轻混匀，37。C水浴消化12小时，期间每2030min振摇离心管1次，以便充分消化；消化结束后，加入IOm1PBS,摇匀后以1000rmin离心4min,弃上清，加入Im1乳腺肿瘤干细胞培养液（含10m11FBS,100Um1青霉素,100mgm1链霉素，10ngm1bFG

9、F,20ngm1EGF,20ngm1ITS的DMEM-F12培养液），混匀，1000rmin离心4min,弃上清;以IX1o6/m1细胞密度接种于细胞培养瓶中，置入37U50m1/1CO2培养箱中培养。3d后换液，约710d开始出现悬浮生长的细胞克隆球。流式细胞术检测获得乳腺肿瘤细胞：收集培养的乳腺肿瘤细胞克隆球，离心并弃去培养基；PBS漂洗1遍，Accutase消化2min后加等体积培养基终止消化；将细胞悬液移入15m1离心管1000rmin离心4min,弃上清，用PBS溶液混悬后无菌滤膜过滤，取4支试管，按如下组合顺序分别加入荧光标记抗体各101:IgG1-PEIgG2-FITC,CD44

10、-FITCIgG1-PE,CD24-PEIgG2-FITC,CD44-FITC/CD24-PE,再力口入5OO1细胞悬液入试管中，混匀，室温避光静置15min,流式细胞仪检测。第二类根据干细胞外排DNA结合荧光染料Hoechst33342而建立的SP细胞分离法在Hoechst33342染色的骨髓细胞中存在着一群染色很浅的细胞群，通过紫外激发后用双波长分别为450nm的蓝色荧光675nm的红色荧光分析，其中有不到0.1%的细胞发出微弱的蓝光和红光,在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧，因此被称为侧群(SP)细胞。SP细胞广泛存在于人和动物的多种成体组织、实体瘤及肿瘤细胞

11、系中，并具有干细胞样特征。实验方法：细胞染色：细胞消化计数，用37。C预热的DF12培养基重悬,调整到1x106i1浓度，制备成单细胞悬液；加入荧光染料Hoechst33342,使终浓度为6gm1,37。C避光水浴90min;冰上10min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1107m1以上,必要时加入1倍的DNaseI;上机前再加入PI使终浓度为2gm1以区分死细胞，并且400滤网过滤细胞。流式细胞仪检测：355nmUV激发光源，610nm双色短通反射滤镜，450nm和675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号.测量前

12、向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性,以HoechstRed为X轴，HoechstB1ue为Y轴作二维散点图，将低HoechstRed及低HoechstB1ue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的门（gate）,计算百分比，分选出SP细胞及NonSP细胞。3 .细胞增殖相关研究方法3.1 MTT分析法MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazo1ium环开裂,生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正必死细胞中琥珀酸脱氢酶消失不能将MTT实验方法：接种XXX细胞用含10%

13、胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积2001o培养细胞同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。呈色培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/m1用PBS配）201o继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加1501DMSo,振荡10min,使结晶物充分融解。比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。3.2 XTTXTT是一种与MTT类似的四嘤氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶

14、性的棕色甲族产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲族的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。实验方法：首先配置6.6mmo1/1XTT溶液和220mmo1/1吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）溶液。临用时将XTT与PMS按1:1混合，形成XTTPMSo接种XXX细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液以每孔IoOO-IOOOO个细胞接种到96孔板每孔体积20010培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。于终止培养前2h,每孔加入XTT/PMS201,混匀后再培养2h0在酶标仪上450nm处测定光吸光度,参考波长为655nmo3.3 WST-I此法是用于测定细胞

15、增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度、高稳定性且无放射性的比色检测法。实验的灵敏度比其它四嘤盐如MTTzXTT,MTS高，线性范围更宽。实验方法：在96孔板加入XXX细胞100j1孔（约IXIO4）,置37oC5%CCh细胞培养箱培养24小时。加入适当浓度的受试化合物。将96孔板在37。含5%82空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。采用WST-I细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，向各孔中加入101的四嘤盐工作液。37。C下孵育14小时。酶标仪在45Onm波长处检测每孔的光密度。3.4CCK-8(WST-8)CCK-8是近年新开发的一种更新的水溶性四D盐检测，原理与WST-I类似：在电子载体I-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(I-MethoXyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲度产物(FormaZan)生成的甲腰物的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，在一定细胞数量范围内甲腰形成的量与细胞数成正比。实验方法：在96孔板中接种细胞悬液(IOO1孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37oC,5%CO2)O细胞经处理后。向每孔加入101CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育14小时。用酶标仪测定在450nm处的