奶牛中酮洛芬残留量的测定液相色谱-串联质谱法.docx

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1、奶牛中酮洛芬残留量的测定液相色谱-串联质谱法DeterminationofKetoprofenresiduesinmi1kby1iquidChromatography-tandemMassSpectrometricmethod目次目次I前言II奶牛中酮洛芬残留量的测定液相色谱串联质谱法11范围12规范性引用文件13原理14试剂和材料25仪器和设备26样品的制备与保存36.1 样品的制备36.2 样品的保存37测定步骤37.1 样品预处理37.2 标准曲线的制备37.3 测定47.4 测定法57.5 空白试验57.6 计算和表述67.7 方法灵敏度、准确度、精密度69.1 灵敏度69.2 准确度

2、69.3 精密度7附录A8BUS本标准的附录A为资料性附录。本标准系国内首次发布的国家标准。牛奶中酮洛芬残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了牛奶中酮洛芬残留量检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶中酮洛芬残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T668

3、2-1992分析实验室用水规格和试验方法3原理试料中残留的酮洛芬，用甲醇提取，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1 酮洛芬对照品：（分子式：Ci6Hi4O3）,含量工99.9%。4.2 酮洛芬-D3内标物：（分子式：Ci6HnD3O3）,含量工99.5%。4.3 甲醇：色谱纯4.4 乙胎：色谱纯4.5 甲酸：色谱纯4.6 水：符合GB/T6682规定的二级水。4.7 酮洛芬标准贮备溶液（1mgm1）：精密称取含酮洛芬标准品50mg置于50m1棕色容量瓶，用30m1甲醇溶解，甲醇定容至刻度，摇匀

4、，即得。分装，置于-20C冰箱避光保存,保存期3个月。4.8 酮洛芬标准工作液：取酮洛芬储备液适量，置于IOm1棕色容量瓶内，用色谱甲醇稀释后定容至刻度，摇匀即得2000ng/m1、1500ngm1,1OOOngZm1500ngm1250ng/m1、1OOngZm150ngm120nng/m1、IOngZm1系列浓度的酮洛芬标准工作液，避光，现配现用。4.9 酮洛芬-D3标准贮备液（Imgm1）：精密称取含酮洛芬D3标准品Iomg置于IOm1棕色容量瓶，用5m1甲醇溶解、定容，摇匀，即得。分装，置于20C冰箱避光保存，保存期3个月。4.10 酮洛芬D3标准工作溶液：取酮洛芬-D3储备液适量，置

5、于Iom1棕色容量瓶内，用甲醇稀释后定容至刻度，摇匀即得500ng/m1、250ng/m1的酮洛芬-D3标准工作溶液，避光，现配现用。4.11 0.1%甲酸水溶液：取1.0Om1甲酸加入I1容量瓶中，再用水稀释定容至刻度，摇匀，即得，现配现用。4.12 0.1%甲酸乙肥：取1.00m1甲酸加入I1容量瓶中，再用乙胞稀释定容至刻度，摇匀，即得，现配现用。4.13 0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙月青溶液（90/10,vv）：量取900m10.1%甲酸水溶液与100m10.1%甲酸乙月青，混匀即得，现配现用。5仪器和设备5.1 富效液相色谱仪：配电喷雾离子源。5.2 电子分析天平：感量0.00001

6、go5.3 天平：感量0.01go5.4 漩涡振荡器。5.5 水平振荡器。5.6 数控超声波清洗器。5.7 高速台式冷冻离心机。5.8 数显恒温水浴锅。5.9 离心管：50m1o5.10 氮吹仪。5.11 MiniPOre-Q超纯水系统。5.12 两用型隔膜真空泵。5.13 可调微量移液器。5.14 滤膜：0.22m05.15 制备与保存1.1 试料的制备取适量新鲜或冷敏的空白或供试牛奶，混合，并使均质。一一取均质后的供试样品，作为供试试料。一一取均质后的空白样品，作为空白试料。一取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6. 2试料的保存-20以下保存。7分析步骤7.1

7、 样品预处理将牛奶样品解冻至室温，涡旋混匀后准确称取Ig试样（精确至0.01g）于50m1具塞聚丙烯离心管中，加入“酮洛芬-D3标准工作溶液”501（浓度为500ngm1）,内标的添加浓度为25ngm1,涡旋混合3min,避光静置30min后，加甲醇4m1涡旋Imin,200r/min水平振荡IOmin后,超声IOmino于4,10000rmin下离心IOmin,取上清液转移至IOm1离心管中。数显恒温水浴锅中40C条件下，氮吹仪干燥。干燥后，向离心管中加入Im1复溶液0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙脯溶液(90：10vv),充分涡旋、复溶，超声IOmin后，于4C,IoOOOrmin离心IOm

8、in,取上清液于孔径为0.22m有机漉膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。7.2 标准曲线的制备取空白奶样，按“7.1”方法进行处理后得到空白基质，在8支1.5m1离心管中各加入0.8m1空白基质，除第1管外，其余各管依次加入1001系列浓度的酮洛芬标准工作液和1001内标标准工作溶液(浓度为250ngm1),旋涡混匀，使牛奶中酮洛芬添加浓度依次为5、10、25、50、100、150、200ngm1,内标添加浓度为25ng/m1。第一管不加药物作空白对照，具体见表1。按照“7.3”方法上机检测。将牛奶中酮洛芬浓度，以酮洛芬特征离子峰面积与酮洛芬-D3特征离子峰面积之比作为纵坐标，对应的浓度为横坐

9、标，绘制标准曲线。求线性回归方程和相关系数。表1牛奶中酮洛芬标准曲线系列浓度表编号01234567空白牛奶提取液量(1)IO(X)800800800800800800800内标的添加体积(1)0100100100100100100100内标工作液浓度(ngm1)0250250250250250250250酮洛芬工作液的浓度(ngm1)050100250500100015002000酮洛芬工作液添加体积(1)0100100100100100100100酮洛芬添加浓度(gkg)05102550100150200内标的上机浓度(gkg)025252525252525酮洛芬上机浓度(gkg)05102

10、5501001502007.3 测定7. 3.1色谱条件73.1.1 色谱柱:AgiIentPUrSUitXRS5-C18(1502.0mm,粒径:5pm),或者相当。73.1.2 柱温：2573.1.3 3流动相：A=水(0.1%甲酸);B二乙晴73.1.4 4流速：0.25m1/min73.1.5 4梯度条件见表2。表2流动相、流速及梯度洗脱表时间min流速/(m1/min)流动相A/(%)流动相B/(%)0.000.2590.010.01.000.2590.010.01.500.2510.090.07.500.2510.090.010.010.08.000.2590.013.000.25

11、90.073.1.6 运行时间：13min73.1.7 进样量：517.3.2质谱条件73.2.1 离子化方式：ESI正离子。73.2.2 干燥气温度：350eCo73.2.3 干燥气流速：91mio73.2.4 喷雾气压力：30psigo73.2.5 5Capi11ary：4000Vo73.2.6 De1UEMV：200Vo73.2.7 Q1分辨率：Unito73.2.8 8Q2分辨率：Unite73.2.9 酮洛芬及其内标的定性和定量离子对和相应的碰撞电压、碰撞能量和驻留时间见表3o表3酮洛芬及其内标的定性、定量离子对、碰撞电压、碰撞能量和驻留时间表化合物离子对（mz）碰撞电压（V）碰撞能

12、量（V）驻留时间（SeC）酮洛芬255.1/209.2*1209200255.1/10512021200酮洛芬内标258.1/212.1*1209200258.1/105120252007. 备注：其中带*的离子对是用来进行定量分析的离子对。8. 4定性测定通过样品色谱图的保留时间与标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准品色谱峰的特征离子相对照定性。样品与标准品的保留时间的相对偏差不大于2.5%；样品特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表4定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至50%

13、10%至20%10%允许的相对偏差20%25%30%50%7 .5定量测定取试样溶液和相应的基质匹配标准工作液，按内标法定量，标准工作液及试样溶液中的酮洛芬的响应值均应在仪器检测的线性范围内。对于方法学验证时的添加回收样品，采用单点校正的方式定量。8 .6空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算和表述计算A255.1/209.2/A258.1/212.1峰面积比值，标准曲线校准。由标准曲线方程：As/Ais=acscis+b式中：AS-对照溶液中酮洛芬的峰面积；Ais-对照溶液中内标酮洛芬-D3的峰面积；CS-对照溶液中内标酮洛芬-D3的浓度，ng/m1；c,is-

14、对照溶液中酮洛芬的浓度，ng/m1；求得a和求则:CiSAC=(b)式中：aAisA-试样中酮洛芬的峰面积；AiS-试样中内标酮洛芬-D3的峰面积；C-供试溶液中酮洛芬的浓度，ng/m1；cis-试样中酮洛芬-D3的浓度，ng/m1；试料中酮洛芬残留量(gkg)：按下式计算：X二口M式中：X-供试试料中酮洛芬的残留量，gkg;V-溶解残余物的体积，m1；m-供试试料质量，g。注:计算结果需扣除空自值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1 灵敏度本方法检测限为1.0gkg,定量限为10.0gkgo9.2 准确度本方法在10.0100.0gkg添加浓度水平上的回收率为80%110%。9.3 精密度本方法的批内相对标准偏差W15%,批问相对标准偏差W20%。附录AaESMRMFriq-I20OVCCX250(251-1050IPPAJd