专利申请案例-利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用.docx

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1、说明书摘要本发明提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用，涉及化学检测技术领域，本发明提供的利用高效液相色谱串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以酮洛芬-D3为检测内标，采用内标标5准曲线法定量。该方法专属性强，检测限低，并且，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.999,表明在此线性范围内的线性关系良好，重复性高。此外，该方法还具有分析时间快，需样量少的优点，能够大大提高样品分析效率。综上，本发明提供的利用高效液相色谱串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，整个操作过程简单易行，方法科学、可靠、可控，适于10实际应用和推广，具有广阔的应用前景。权利要求书1 .一种利用高效

2、液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，所述方法以酮洛芬D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。2 .根据权利要求1所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮5洛芬的方法，其特征在于，所述利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法包括：提供酮洛芬标准溶液、酮洛芬内标溶液以及预处理后的待测样品，利用液相色谱串联质谱仪对酮洛芬标准溶液和预处理后的待测样品分别进行检测，通过绘制标准曲线，得到血浆中酮洛芬的含量；10其中，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液进行沉淀蛋白处理，取上清稀释除杂后，得到所述预处理后的待测样品。3.根据权利要求2所述的利

3、用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，将酮洛芬标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/m1的酮洛芬醇溶液，得到所述酮洛芬标准溶液；15优选地，所述酮洛芬醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/m1,优选为0.8-1.2mg/m1;优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬标准溶液。4.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮20洛芬的方法，其特征在于，将酮洛芬-D3标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/m1的酮洛芬D3醇溶液，得到所述酮洛芬内标溶液；优选地，所述酮洛芬-D3醇溶液的浓度为0.5-1

4、.5mg/m1,优选为0.8-1.2mg/m1;优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；25优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬内标溶液。5 .根据权利要求2所述的利用高效液相色谱.串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液静置，再加入乙睛进行蛋白沉淀；优选地，所述乙月青与酮洛芬内标溶液的体积比为15-25:1,优选为518-22:1,更优选为18-20:1;优选地，在避光条件下静置。6 .根据权利要求2所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，取一系列不同浓度的酮洛芬标准溶液加入空白血浆样品中

5、，经预处理后，利用液相色谱-串联质谱仪进行检测，并分别记io录每个浓度的酮洛芬对应的峰面积，以酮洛芬与内标峰面积比值Y为纵坐标，以酮洛芬浓度X为横坐标，绘制所述标准曲线。7 .根据权利要求1-6任一项所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，高效液相色谱条件如下：色谱柱：AgiIentRS-C18色谱柱；和/或，15柱温：30-50C;和/或，流动相：A相为0.1%(V/V)的甲酸溶液，B相为乙睛；和/或，流速：0.1-1.0m1/min;和/或，进样量：1-101;和/或，线性梯度洗脱程序：起始比例A相为87%,B相为13%,维持1min;201-1.5min,A

6、相降至10%,B相升至90%,维持至7.5min;7.5-8min,A相升至87%,B相降至13%,维持至12.0min。8 .根据权利要求1-6任一项所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，质谱条件如下：离子源：ESI;和/或，25干燥气温度：300-400C;和/或，干燥气流量：5-151/min;和/或,雾化气压力：30-50psi;和/或，毛细管电压:3500-4500V;和/或，检测模式：正离子扫描的多反应检测模式。9 .根据权利要求8所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮5洛芬的方法，其特征在于，所述酮洛芬和酮洛芬-D3的质谱参数见下表：化合物

7、名称母离子m/z子离子m/z碎裂电压碰撞能量V驻留时间ms酮洛芬255.1209.2*1205200105.012018200酮洛芬-D3258.1212.1*1206200105.012014200注：*标注的子离子为定量离子。10.如权利要求1-9任一项所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。说明书利用高效液相色谱串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用5技术领域本发明涉及化学检测技术领域，尤其是涉及一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用。背景技术10酮洛芬(Ketoprofen)又名酮基布洛芬，属于芳基丙酸群，非给体类抗炎药。

8、白色结晶性粉末，无臭或几乎无臭。在甲醇中极易溶，在乙醇、丙酮或乙醛中易溶，在水中几乎不溶。酮洛芬消炎作用强，副作用小，毒性低。其主要作用机理是通过抑制花生四烯酸的环氧化酶通路，从而导致炎症因子的减少，如前列腺素和血栓素。这种作用机理导致的结果是产生抗15炎、解热和镇痛等效果。目前在兽医上，酮洛芬使用越来越广泛，国外将其应用于猪、马、牛、山羊等。在牛上，酮洛芬可以用来治疗发热、疼痛和炎症等相关症状的疾病，包括乳腺炎、乳腺水肿、关节炎和肌肉骨骼外伤。建立牛血浆中酮洛芬含量的检测方式，可以指导临床合理用药。而目20前检测血浆中酮洛芬含量的方法主要有：滴定法、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法(HP1

9、C)等，其中国内外最常用的是高效液相色谱法(HP1C),但高效液相色谱法灵敏度不高，检测限的浓度高，检测时间长，需要样品量较大。因此，开发一种快速、高效、灵敏度高的酮洛芬含量检测方式尤为重要。有鉴于此，特提出本发明。5发明内容本发明的第一个目的在于提供一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以缓解现有技术中存在的检测方法灵敏度不高，检测限的浓度高，检测时间长，需要样品量较大的技术问题。本发明的第二个目的在于提供上述利用高效液相色谱-串联质谱法检测10血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。本发明提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，所述方法以酮洛芬-

10、D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。进一步地，所述利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法包括：15提供酮洛芬标准溶液、酮洛芬内标溶液以及预处理后的待测样品，利用液相色谱-串联质谱仪对酮洛芬标准溶液和预处理后的待测样品分别进行检测，通过绘制标准曲线，得到血浆中酮洛芬的含量；其中，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液进行沉淀蛋白处理，取上清稀释除杂后，得到所述预处理后的待测样品。20进一步地，将酮洛芬标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.12.0mg/m1的酮洛芬醇溶液，得到所述酮洛芬标准溶液；优选地，所述酮洛芬醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/m1,优选为

11、0.81.2mg/m1;优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；25优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬标准溶液。进一步地，将酮洛芬D3标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/m1的酮洛芬-D3醇溶液，得到所述酮洛芬内标溶液；优选地，所述酮洛芬D3醇溶液的浓度为0.51.5mg/m1,优选为0.8J.2mg/m1;5优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬内标溶液。进一步地，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液静置，再加入乙睛进行蛋白沉淀；优选地，所述乙月青与酮洛芬内标溶液的体积比为15-25:1,优选为1018

12、-22:1,更优选为18-20:1;优选地，在避光条件下静置。进一步地，取一系列不同浓度的酮洛芬标准溶液加入空白血浆样品中，经预处理后，利用液相色谱-串联质谱仪进行检测，并分别记录每个浓度的酮洛芬对应的峰面积，以酮洛芬与内标峰面积比值Y为纵坐标，以酮洛芬15浓度X为横坐标，绘制所述标准曲线。进一步地，高效液相色谱条件如下：色谱柱：AgiIentRS-C18色谱柱；和/或，柱温：30-50C;和/或，流动相：A相为0.1%(V/V)的甲酸溶液，B相为乙聘；和/或，20流速：0.1-1.0m1/min;和/或，进样量：1101;和/或，线性梯度洗脱程序：起始比例A相为87%,B相为13%,维持1m

13、in;1-1.5min,A相降至10%,B相升至90%,维持至7.5min:7.5-8min,A相升至87%,B相降至13%,维持至12.0min25进一步地，质谱条件如下：离子源：ESI：和/或，干燥气温度：300-400C;和/或，干燥气流量：5-151/min;和/或，雾化气压力:30-50psi;和/或，毛细管电压：3500-4500V；和/或，5检测模式：正离子扫描的多反应检测模式。进一步地，所述酮洛芬和酮洛芬-D3的质谱参数见下表:化合物名称母离子m/z子离子m/z碎裂电压碰撞能量V驻留时间ms酮洛芬255.1209.2*1205200105.012018200酮洛芬D3258.1

14、212.1*1206200105.012014200注：*标注的子离子为定量离子。另外，本发明还提供了上述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。10本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以酮洛芬-D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。该方法专属性强，检测限低，在牛血浆中酮洛芬的含量的检测限为1ngm1,定量限为5ngm1,远远低于目前酮洛芬在高效液相色谱法中检测限为IOOngm1,定量限为200ngm10并且，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.999,15表明在此线性范围内的线性关系良好，重复性高。此外，该方法还具有分析

15、时间快，需样量少的优点，能够大大提高样品分析效率。综上，本发明提供的利用高效液相色谱串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，整个操作过程简单易行，方法科学、可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。20附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普5通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例2提供的空白样品总离子色谱图；图2为本发明实施例2提供的基质中添加酮洛芬浓度10ng/m1的总离子色谱图；10图3为本发明实施例3提供的基质中添加酮洛芬浓度1ng/m1的总离子色谱图；图4为本发明实施例3提供的基质中添加酮洛芬浓度5ng/m1的总离子色谱图；图5为本发明实施例4提供的第一批牛血浆添加标准曲线回归方程与15相关系数图；图6为本发明实施例4提供的第二批牛血浆添加标准曲