HPLC色谱柱十大误解.docx

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1、HP1C色谱柱十大误解在任何领域，通常都存在着“误解”或“神话”，这些误解或神话一直延续到下一代，这些误解通常是由于从业人员对实际问题缺乏了解而引起的。本次将围绕高效液相色谱（HP1C）色谱柱技术的10个最流行的误解以揭开其神秘面纱,误解1:无法反转HP1C色谱柱假。实际上，高效液相色谱（HP1C）色谱柱的填充压力要比其最大操作压力高得多（通常是其两倍）。因此，如果使用适当的溶剂并分配了稳定填充床所需的时间，则填充良好的色谱柱应该能够在两个方向上工作。人们可能想使色谱柱沿相反方向流动的一些原因包括：在色谱柱切换中进行反吹操作，用顽固强力吸附的样品冲洗色谱柱的入口。冲洗捕获的颗粒以减少压力积聚。

2、反相HP1C色谱柱的流程有一个例外。如果制造商在色谱柱入口处使用了较高孔隙率的玻璃料，则可以通过反转色谱柱将颗粒从填充床中冲洗掉。在工厂包装色谱柱时，在色谱柱出口处的熔块孔隙率必须低于色谱柱的最小粒径。例如I,如果色谱柱填料的平均直径为5Um,粒径分布为3-7m,则色谱柱出口处使用的玻璃料必须小于3m,这样就不可能有颗粒逸出填料使用色谱柱时要铺床。例如，大多数制造商选择2m的玻璃料。制造商为何在色谱柱的入口和出口处有不同的孔隙度？简单。较高孔隙度的玻璃料比较低孔隙度的玻璃料具有更少的堵塞趋势。05m的玻璃料比2m的玻璃料堵塞更快。因此，为防止压力迅速增加和客户抱怨,制造商可能在入口处使用宽容度

3、更大的多孔玻璃料。通常,该列将用箭头标记，指示仅应在一个方向上使用它。反转HP1C色谱柱之前，最好查阅色谱柱说明书或与色谱柱制造商联系，以查看色谱柱是否可以反转。误解2：所有C18（11）列都相同假。在HP1C的早期，十八烷基硅烷（最常被称为ODS或C18相）是最早可用于称为“反相色谱”的新技术的键合固定相之一。它成为了反相色谱的标准相，并被大多数从业者迅速采用。由于制药业是HP1C的较早采用者，并且监管机构不想加持特定制造商的色谱柱品牌,因此，美国食品药品管理局（FDA）和美国药典（USP）开发了一种分类系统，该分类系统为在新药申请下提交的每种新方法。对于HP1C色谱柱，给定了“1”标记，并

4、且由于大多数提交物中都使用了C18,因此它变为“11”。随着添加附加相，它们被赋予了自己的“1”编号（例如，17C8,11OCN,111苯基等）。不幸的是，该指定系统被证明是不可靠的，因为使用硅胶作为基础材料，每个商业C18色谱柱的合成方法都不相同，并且所得反相色谱柱具有不同的性能。例如，一些制造商使用十八烷基一氯硅烷和低表面积硅胶（图1）,而其他制造商使用相同的硅烷，但将其粘合到更大表面积的硅胶上。这两个C18色谱柱的行为会有所不同，后者的C18相比前者更多。较低覆盖率的键合相有时含有未反应的硅烷醇，从而导致混合的保留机理。一些制造商使用二氯硅烷和三氯硅烷，并使键合相聚合形成具有不同扩散特性

5、的较厚层。为了减少在键合过程后残留的未反应的硅烷醇，一些制造商使用少量的硅烷（例如三甲基一氯硅烷）封端了这些硅烷醇。硅烷醇有时负责碱性化合物在中等PH值下的拖尾作用。一些制造商使用聚合物基材料，然后将C18部分结合到其表面上，从而形成完全不同的C18包装材料，但仍被认为是“111其他人则使用表现出不同程度的反应性的有机烷氧基硅烷，并且可以产生与有机氯硅烷试剂相比稍有不同的C18键合相。Figure1:SynthesisofC18mono1ayerbondedphasesi1icaforRPC因此，即使今天，“C18不是C18也不是CI8”这一说法仍然成立。所有C18相都不相同,用户应确保开发出

6、一种方法后，并坚持使用相同的色谱柱部件号，以确保方法坚固耐用。误解丸保护柱不影响分离假。首先，有一个保护柱是个好主意。但是，如果选择了错误的配置或相位，保护柱的选择会对分离产生很大影响。请记住，保护柱的目的是保护分析柱免受高度保留的样品组分，微粒和其他不良物质的污染。保护柱比它保护的分析柱便宜得多。因此,它可以更频繁地更换，而不是更昂贵的分析柱。理想情况下,选择的保护柱应具有与分析柱完全相同的固定相。如果该相更具保留性（例如，具有更大的碳载量或为混合模式相），则它可能通过引起保留时间偏移甚至选择性差异而以有害的方式影响分离。如果该相的保持力较弱，则可能会或可能不会引起问题，除非所选的相影响了整

7、体选择性。为了使保护柱对分离性能的影响最小，必须将保护柱正确地插入流路中。显然，保护柱插入在进样器和分析柱之间，但是如果使用过多的连接管（过长或两个内径较大），则会发生柱外带扩展，从而影响整体分离。采用集成保护柱的系统会提供最佳解决方案，其中保护柱实际上与分析柱对接。但是，集成式保护柱通常与盒式色谱柱系统相关联，这似乎已受到人们的青睐。无论采用哪种配置，保护柱都应能够轻松卸下并从HP1C系统中更换，而不会影响其操作。从理论上讲，如果保护柱在分析柱上增加了额外的柱长，则应该产生额外的塔板，从而增加色谱分离度。但是，由于前面讨论的一些因素，通常添加保护柱只会使分离效果保持最佳状态，有时甚至会降低分

8、离效果。保护柱的优点是延长了色谱柱的使用寿命，并不一定增加总效率。误解4：高温总是导致更好的分离假。随着温度升高，流动相的粘度降低，因此，溶质传质的速率应增加，从而提供更好的色谱效率。的确如此，但是除了色谱柱效率项（H）之外，温度还会影响保留因子（k）和选择性（对这些术语的影响会导致分辨率提高（这是色谱分析中我们真正关心的问题）或有损分辨率。保留时间通常随温度升高而降低，因为作为热力学参数，分析物更喜欢保留在流动相中，并从色谱柱中更快地洗脱出来。但是，不同的化学物种其保留度随温度变化的程度可能不同。更正确地说，它们的范霍夫图（InkVS1/T,其中温度T以开尔文为单位）可能显示不同的斜率。换句

9、话说，它们的a值可以改变。另外，高温会导致低k峰被迅速洗脱，以至于它可以在to或接近t时洗脱，即未保留的峰保留时间，因此难以量化。以图2为例，该系列色谱图显示了在20-90C的柱温下七种止痛药的分离。可以注意到色谱图的几个特征。首先，随着温度的升高，所有峰的保留降低，并且峰的确变窄，表明效率提高。其次，相对于最接近的洗脱化合物峰5和6,一种止痛化合物水杨酸随温度的保留变化更大。实际上，将温度从20。C升高到40。C后，洗脱顺序颠倒了。在30C的中间温度下，水杨酸和峰号6,非那西丁被共洗脱。因此，在这种情况下，高于40。C的温度会使整个分离过程的分离时间缩短，但洗脱顺序却从较低的温度开始发生变化

10、。Figure2:Effectofchangingco1umntemperatureonse1ectivityandretentionofana1gesics.Co1umn:50mm4.6mm,1.%-mdpZorbaxRRHTSB-C18;mobi1ephaseA:0.1%formicadd;mobi1ephaseB:acetonitri1ewith0.1%formicacid(85:15);detection:UVabsorbanceat254nm.Peaks:14*acetamIdopheno1,2:caffeine,32acetamidopheno1,4=acetani1ide,5=a

11、cety1sa1icy1icacid.当然，在较高温度下操作的另一个好处是降低了色谱柱的工作压力，使操作人员可以使用更高的流速或更小的颗粒。在较高温度下可能引起色谱柱性能问题的另一个实验参数是进入的流动相可能存在的热失配。例如，如果将色谱柱加热到60C且进样的溶剂处于室温，则进样的较冷的溶剂会导致峰变形，因为溶质在色谱柱的初始部分可能会经历温度差异。当使用更高的色谱柱温度时，建议对流动相进行预热。误解5：碳载量越高，反相塔越好假。对于流行的烷基键合相，似乎对链长，碳载量，表面覆盖率等的作用存在误解。通常,对于真正的反相机理，其中保留是基于分析物分子的相对疏水性，保留通常是基于碳载量。碳负荷越高

12、，保留率越高。碳负荷可以与链长成正比，但不一定如此。典型的硅胶具有约8.0mo1m2的反应性硅烷醇，用于键合有机硅烷试剂。例如，如果对于单层键合相的给定表面覆盖率（以微摩尔每平方米为单位），链长越长，碳原子就越多，因此保留率将与链长成正比。但是，如果较短的链键合相（例如C8）具有较高的表面覆盖率，从而导致表面上有更多的碳，则与C18键合相相比，它可能具有更多的保留。另外，一些制造商使用二氯和三氯有机硅烷，其中使用聚合来增加相覆盖率。可以想象，较短链长的聚合物相比较长链单体的相具有更大的覆盖率。有时，这些聚合物相的键合相层较厚，与单体相相比，固定相的质量传递较差.负载量很大的反相色谱柱也容易发生

13、相塌陷或更准确地说是固定相去湿。3对于此类色谱柱,当有机改性剂的量在水性环境中降至10%以下时，这些“油状”疏水相往往会倾向于自缔合而不是处于极性水溶液中（也就是说，喜欢喜欢）。因此，在这种情况下，高碳载量可能不利于成功的反相色谱分析和可再现的保留时间。误解6：使用填充较小颗粒的色谱柱，总能获得更高的效率假。尽管对于填充良好的色谱柱，随着填充色谱柱中颗粒平均直径的减小，效率会提高，但如果柱外对特定HP1C硬件系统的谱带扩宽的贡献足够高，则该色谱柱的全部性能将无法获得被实现。柱外成分包括填料本身以外的所有其他体积。这些贡献包括以下内容：进样量包括回路尺寸以及进样阀内的其他体积。从进样器出口到色谱

14、柱入口的油管容积。保护柱间隙的体积，包括端接头（如果有）。在线过滤器体积（如果有）。入口色谱柱接头内的内部容积包括多孔熔块和流动通道。间隙列的体积。底部色谱柱接头内的内部容积包括多孔玻璃料和流动通道。从色谱柱出口到检测器入口的油管容积。流通池之前的检测器内的管道容积。流通池体积。所有这些体积的方差都是累加的。因此，可以最大程度地减少进样量并使色谱柱入口管的长度短，内径小，但如果从色谱柱出口到检测器的连接管有Im的0.20英寸，则谱带展宽可能足够大影响分离的整体效率。因此，如果您希望获得亚2mHP1C色谱柱或内径为1Omm的色谱柱的预期效率，请确保将柱外效应降至最低。误解7：对于硅胶填料，残留的

15、硅烷醇导致拖尾峰假。在某些情况下，存在于所有基于硅胶的键合相色谱柱上的硅烷醇会引起拖尾，特别是对于碱性化合物而言。这种拖尾归因于硅烷醇基团是一种弱酸，PKa约为45-4.7.因此，当流动相的PH值接近45时，硅烷醇被离子化，并可以通过静电吸引作用与带正电的分子（如质子化的胺）相互作用。通过将PH值降至3以下来抑制硅烷醇的离子化，可以最大程度地减少这种相互作用。对于某些碱性化合物，有时在较低的PH值下会出现拖尾现象。有专门设计的反相填料，可以为碱性化合物提供良好的峰形。峰拖尾的三个基本原因：化学问题（其中一个己在前面讨论过）；色谱柱填充问题；和仪器硬件问题。所有这三个因素都可能导致峰拖尾,并且一

16、个必须调查根本原因以确定补救措施。详细讨论所有这三个问题不在此问题的范围内，但是每种类型的一些示例将为您提供总体思路。首先，除了与硅烷醇的相互作用外，与化学有关的拖尾问题还可以通过几种方式表现出来。金属螯合化合物可与色谱柱填充物中的微量金属发生相互作用，这对于较旧的二氧化硅材料尤为明显。使用错误的注射溶剂有时会导致拖尾。用比流动相强得多的溶剂注入样品会产生峰形失真。尾矿可能是由于色谱柱顶部强烈保留的样品组分或流动相杂质造成的堆积材料引起的。这种材料可以充当不同的固定相，从而导致相互作用的化合物出现拖尾问题。有时会出现混合模式，从而导致拖尾。在这里，溶质可以通过反相和离子相互作用与活性基团相互作用。有时，当流动相的PH值错误并且样品被部分电离时，所产生的峰可能会失真并且类似于拖尾。较大峰背面的部分共溶峰较小，有时看起来像拖尾。色谱柱填充问题可能导致峰拖尾。色谱柱顶部的空隙会导致