人用疫苗规模化生产工艺与技术.docx

《人用疫苗规模化生产工艺与技术.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人用疫苗规模化生产工艺与技术.docx（10页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、疫苗在保障国民健康和国家生物安全方面发挥了巨大作用。我国自实施计划免疫以来，传染病的发病率和死亡率得到有效控制，成功消灭了天花、脊髓灰质炎和孕妇新生儿破伤风，常见儿童传染病如麻疹、腮腺炎、风疹、百日咳、白喉、破伤风、乙型性脑炎、流行性脑脊髓膜炎等疾病的发病率和死亡率下降幅度在95%以上，乙肝感染降到1%以下，具有巨大的社会效益和经济效益。我国疫苗产业虽已取得了长足的进展，但疫苗产业的自主创新能力、新产品转化、关键核心技术应用、规模化生产工艺和技术水平，同发达国家相比仍有一定差距。而且随着全球经济一体化和社会的迅速发展，抗生素滥用、大气污染等多种因素影响，传染病的多发和高发态势仍然没有得到根本改

2、变，生物恐怖的危害也不断加剧，一些重大疾病及新发、突发传染病，如艾滋病、流感、登革热、手足口病、埃博拉等仍严重威胁着人类生命健康。1、国内外灭活病毒性疫苗的生产工艺与技术灭活病毒性疫苗为通过化学、热处理或辐射处理经培养纯化的病毒性疫苗，其主要优点是：与活病毒疫苗相比更稳定和安全，不会发生因疫苗接种而导致的感染；被灭活但仍可被机体的免疫系统识别，并产生有效的免疫应答；可用于免疫系统相对较弱的个体；稳定性较好，无需冷冻，方便运输。其缺点主要为免疫原性相对较弱，一般需进行多次接种。目前已经上市的灭活病毒性疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、人用狂犬灭活疫苗、乙型脑炎灭活

3、疫苗、双价肾出血热灭活疫苗（表1）1。投苗品种生产用毒种细胞基质培养方式生产规模纯化方式灭活剂许的灰侦炎灭活枝苗Sa1k株、Sabin株Vero细胞、MRC5细胞做我体生物反应器、细胞U-IOOO1（SaIk株）55O1（Sabin株）层析甲醛（先纯化后灭活甲型肝炎灭活残苗M毒株人二倍体细胞细胞r厂、转粮层析或其他甲能（先纯化后灭活流感病毒灭活痰苗确胚适应株再胚细胞T根层析或蕉犍桧度梯度超速离心甲解（先灭活后纯化）乙型脑炎灭活疫苗乙脑病毒P3株Vero细胞、凤脑细胞细胞匚厂、转瓶港糖密度悌度超速离心甲醛（先灭活后纯化）人用狂犬灭活疫苗狂犬病病毒（因定毒）Vero细胞、人一倍体细胞、地以肾细胞细

4、胞工厂、转瓶、反应器层析或在Wi密度梯度加速离心任内内Si（先灭活后纯化）双价肾出血热灭活疫苗端齿类动物分黑株Ver。细胞、地Iu肾细胞、沙鼠行细胞细胞工厂、转瓶层析6-内内Si（先灭活后纯化）肠道病毒71型灭活疫苗临床分卷株宜。细胞、人二倍体细胞生物反应器、细胞匚厂、转瓶1501（生物反应器）层析或蔗W1率度悌度超速离心甲解（先纯化后灭活）表1已上市灭活病毒性疫苗细胞基质和培养方式目前国内外灭活病毒性疫苗的细胞基质主要为人二倍体细胞、原代细胞、鸡胚细胞和VerO细胞。其中人二倍体细胞主要有2BS株、KMB-17株、WI-38株和MRC-5株。各种细胞的特性不一样，培养方式也不一样。人二倍体细

5、胞传代比例和传代代次比较受限，不利于大规模细胞培养，且对培养基和牛血清质量要求较高。原代细胞主要有地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞，操作繁琐，存在外源因子污染风险。人二倍体细胞和原代细胞的培养方式主要为转瓶、细胞工厂，这两种培养方式较为传统，每批培养体积较小，较为费时费力，其生产规模仅仅是转瓶或细胞工厂数量上的增加，难以规模化放大。Vero细胞是第一个可连续传代的哺乳动物细胞，来源于非洲绿猴肾细胞，目前广泛用于疫苗的生产，为灭活病毒性疫苗常用的细胞基质。国内外主要采用微载体生物反应器进行Vero细胞培养。与细胞工厂培养方式相比，微载体生物反应器培养具有明显的优点：可进行高密度培养；可保证细胞在规定细胞传

6、代限定代次内进行分级放大，易于进行规模化放大。国外已有企业建立了在8周内从Im1安瓶到60001生物反应器的Vero细胞放大生产工艺，在整个规模化放大过程中VerO细胞的产量和活性并不降低。表2显示了不同反应器规模细胞培养的生长状态。从中可以看出，在反应器内进行1560001规模化放大培养时，Vero细胞密度体现较好的一致性。培养人数15111101600O1细胞密度(Xio个n1)1ND0.240.210.2620.430.400.400.403ND0.680.790.7741.271.161.301.245ND1.671.721.7961.822.072.052.1572.082.421注

7、：“ND”表示“notdetect”表2不同规格生物反应器培养VerO细胞正是由于Vero细胞在病毒性疫苗生产中的应用，使得现代病毒性疫苗的生产进入工业化、规模化时代，生产过程更加可控，批间一致性更好。目前国内外主流的以Vero细胞为基质的疫苗生产均采用微载体生物反应器培养工艺。以Vero细胞为基质生产的灭活病毒性疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、狂犬病灭活疫苗、日本乙型脑炎灭活疫苗，目前Vero细胞还被用于小儿轮状病毒活疫苗Rotateq1(Merck)和Rotarix1(葛兰素史克)、H5N1大流感疫苗Pref1uce11(Baxter)4x日本脑炎疫苗Ixiaro1(Interce11)的生

8、产。此外,还被批准用于天花活疫苗ACAM20001(SanofiPasteur)的生产。Vero细胞等传代细胞培养均采用含血清培养但含血清培养对于病毒性疫苗的下游纯化也有较高的要求，需要严格控制血清中BSA的含量、纯化的回收率等一些关键的指标，所以无血清细胞培养技术成为国内外细胞培养研究热点之-oVero细胞的研究的另一个热点是进行细胞悬浮化高密度培养。与使用微载体不同，细胞进行悬浮化培养后，细胞的贴壁特性发生了改变，细胞不需要消化可直接传代，并且可以提高细胞的发酵密度。生产工艺国内外的灭活病毒性疫苗均需要经过收获、澄清、浓缩、纯化、灭活等生产工艺。其中纯化主要采用柱层析或蔗糖密度梯度离心法。

9、这两种方式各有优缺点：层析法便于线性放大，批间一致性较好，但是试剂成本较高；蔗糖密度梯度离心法纯化的抗原成分单一，可有效区分空心和实心病毒颗粒，但每批处理量较小，后期需要除糖处理。国内外上市的灭活病毒性疫苗多采用层析纯化工艺。目前病毒灭活主要采用B-丙内酯和甲醛两种灭活剂。-丙内酯常温下是无色黏稠状液体，主要通过作用于病毒RNA从而达到灭活病毒的效果。目前上市的疫苗中采用-丙内酯灭活的主要有狂犬疫苗和双价肾出血热灭活疫苗。在疫苗研究初期人们就已使用甲醛进行细菌和病毒性疫苗的灭活。甲醛对于病毒核酸和蛋白质都具有破坏作用。甲醛对单链核酸的破坏最为有效，因此常被用于RNA病毒的灭活。脊髓灰质炎灭活疫

10、苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、乙型脑炎灭活疫苗等均采用甲醛灭活工艺。质量控制灭活病毒性疫苗的主要控制指标为病毒抗原活性成分、纯度以及宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白（HCP）、灭活剂等的残留成分控制。纯度的检测方法主要有HP1C、SDS-PAGE或比活等指标。其中不同疫苗对Vero细胞残余DNA含量要求不太统一，WHO生物学标准化专业委员会评估残留DNA引起的转化事件的风险后认为注射产品的DNA含量每剂小于IOng均可以接受5。目前，国内的狂犬疫苗等中的VerO细胞残余DNA含量标准为每剂不高于IOOPg。但美国上市的IPV（IPo1,SanofiPasteur）Vero细胞残余DNA含

11、量每剂低于IOpgo国内上市的sIPVDNA含量为每剂不高于50pgoVero细胞HCP含量一般为每剂不高于50ngo2多糖蛋白结合疫苗规模化生产工艺与技术2. 1国外行业现状2.1.1 肺炎球菌结合疫苗目前，全球已上市的肺炎球菌结合疫苗有3种，分别是惠氏（Wyeth）公司生产的7价肺炎球菌结合疫苗Prevnar7（2000年上市）和13价肺炎球菌结合疫苗PrevnarB（2010年上市），以及葛兰素史克公司生产的11价肺炎球菌结合疫苗Synf1orix（2009年上市）6-8。（1）PrevnarPrevnar7配方中包括了4、6B、9V、14、18C、19F、23F共7个血清型的结合物，P

12、revnar13包括了1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13个血清型的结合物，比Prevnar7多6个型别的结合物（1、3、5、6A、7F、19A）,两者均以CRM197为载体蛋白，均为磷酸铝佐剂吸附剂型。惠氏公司结合物制备采用的工艺路线为：将天然多糖进行酸水解降低分子量至适宜范围（有些型多糖在氧化反应中自行降解，不需要预先进行水解），用高碘酸钠氧化多糖邻羟基使多糖重复单位产生醛基,醛基与CRM197分子上的氨基，在还原剂（如NaBH4）存在的条件下发生还原胺化反应生成酰胺键，该方法被称为还原胺化法。这种方法的优点是对多糖重复单位上的邻羟基进行可控的

13、修饰，不破坏多糖分子的其他结构，易于质控。缺点是还原胺化反应需要的时间较长，有的型结合反应需要5d。在O.5m1Prevnar13中，有12种血清型多糖各2g,4g6B型多糖，0.125mg磷酸铝佐剂。Prevnar13的剂型为不含胶乳的单剂预充式注射器灌装注射液9-10。（2）Synf1orixSynf1orix配方包括1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F共10个血清型结合物。该产品使用了3种不同的载体蛋白，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、23F载体蛋白为不可分型流感嗜血杆菌表面蛋白D（PD）,19F载体蛋白为白喉类毒素（DT）,18C载体蛋白为破伤风类毒素（T

14、T）。剂型同样为磷酸铝佐剂吸附剂型（0.5mg磷酸铝佐剂/齐I）。每剂疫苗含1、5、6B、7F、9V、14、23F这7个血清型多糖各1g,4、18C、19F各3g所采用的技术路线为对除5、6B、23F这3个型外的其他天然多糖分子进行微流化microf1Uidization）处理以降低分子量，在不同条件下用1-氟基4（二甲氨基）口比嚏四氟硼酸盐1-cyano-4-（dimethy1amino）pyridiniumtetraf1uo-roboratezCDAP将多糖的羟基活化为氨酸酯，活化后的多糖的氟酸酯通过与载体蛋白或己二酸二酰曲（adipicdihydazide,ADH）衍生的载体蛋白的氨基或

15、脱基形成异胭衍生物而实现结合。其原理与传统的漠化富活化法相同，但活化条件更加温和，活化物副反应发生率低，对多糖的结构改变较少。与还原胺化法相比，耗时少。此方法的缺点是活化时间仅几十秒，要在这几十秒内对溶液迅速变化的PH进行控制并不容易，由于多糖活化和结合是连续完成的，难以对多糖活化进行有效质控，反应条件偏碱性，对多糖上碱性条件敏感的基团难免会造成破坏，结合载体蛋白利用率不高11。2.1.2 脑膜炎球菌多价结合疫苗当前国际上脑膜炎球菌结合疫苗的发展趋势为包含A、C、Y、W135等4个血清群的多价结合疫苗，目前全球已上市的有3家产品，分别为赛诺菲巴斯德的MenaCtra、诺华的MenVeO(2014年被葛兰素史克收购)、葛兰素史克的Nimenrixo此外，还有一种联合疫苗，葛兰素史克的C、Y群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其产品名为Menhibrixo(1)Menactra液体剂型，2005年获得批准上市，规格为0.5m1,其中含A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖各4g,含载体蛋白白喉类毒素DT约48g其基本工艺