最新：慢加急性肝衰竭的疾病动物模型和研究进展.docx

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1、最新：慢加急性肝衰竭的疾病动物模型和研究进展慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic1iverfai1ure,AC1F)是一类在慢性肝病基础上发生的以急性肝功能失代偿、肝外器官损伤和高短期死亡率为主要临床特征的严重临床综合征，病死率极高(50%-90%I动物模型对于更好地阐明AC1F的发病机制、开发并验证新的治疗方法都至关重要。然而，由于AC1F病因复杂、并发症众多，高度模拟临床的动物模型开发存在较大挑战。在重肝在线第111期-暨中国重症肝病研究小组成立会议上上海交通大学附属瑞金医院的项晓刚教授分享了慢加急性肝衰竭的动物模型和研究进展，肝胆相照平台特将精华整理成文，以飨读者。一、慢加急

2、性肝衰竭(ACUte-On-ChroniC1iverfai1ure,AC1F)的特征及机制从1995年提出AC1F的概念后,公认AC1F存在两种损伤，一种是持续存在，一种是急性发生。AC1F的临床特征是慢性肝病损伤在遭受急性打击后进入肝功能失代偿阶段，出现黄疸、凝血异常、腹水、肝性脑病以及肾功能损伤等症状，最终导致多器官功能衰竭。AC1F的发病机制主要是在慢性肝病基础上遭受急性打击后,坏死的肝细胞会迅速释放损伤相关的模式分子（damageassociatedmo1ecu1arpatterns,DAMPS）,激活免疫反应和全身炎症反应。早期表现为免疫过度激活，中晚期表现为免疫衰竭或免疫麻痹并发细

3、菌感染，诱发病原体相关的模式分子（PathOgen-associatedmo1ecu1arpatterns,PAMPS）的大量释放并再次激活全身炎症反应,导致免疫介导的器官功能失常，最终导致多器官功能衰竭。从临床特征和发病机制上可以看出，AC1F造模的关键是肝脏急慢性损伤和细菌感染。二、诱导肝损伤的方法诱导肝脏损伤的方法包括以下三类： 肝毒试剂：CC14（四氯化碳）、D-Ga1N（D-氨基半乳糖）、TAA（硫代乙酰胺）、APAP（对乙酰氨基酚）、ConA（刀豆凝集素A）; 异源血清：HSA（人血清白蛋白）、PS（猪血清）; 手术方式：BD1（胆管结扎术）。1、肝毒试剂I）CC14（四氯化碳）C

4、CI4针对肝脏毒性剧烈，可皮下、肌肉或腹腔注射、口服和吸入。可导致肝细胞损伤和小叶中心坏死。常用于诱导肝纤维化或肝硬化。会影响细胞代谢，使阳离子平衡失调，激活细胞色素P450酶。优点是应用便捷，价格便宜，但是具有毒性和挥发性，应在通风橱中使用。2）D-GaIN（D-氨基半乳糖）D-GaIN也是强效的肝毒性试剂,可以干扰肝细胞磷酸尿喀D定核苗的合成,可造成肝弥漫性坏死和炎症，大剂量可造成致死性肝损伤。能增强1PS（细菌脂多糖）针对肝脏的敏感性Q-GaIN联合1PS广泛用于急性肝衰竭和内毒素血症动物模型。3）TAA（硫代乙酰胺）TAA是一种间接肝毒性物质，在CYP4502E1催化下两步转化为硫代酰

5、胺亚飒和硫乙酰胺二氧化硫（TASo2）。TAS02是TAA的主要代谢产物，通过氧化应激和下调分解代谢酶能导致肝细胞损伤、坏死和凋亡常用于急性或慢性肝损伤。人体接触后有强致癌性（2B级）。4）APAP（对乙酰氨基酚）APAP是最广泛使用的解热镇痛药，人体过量摄入能导致严重急性肝损伤甚至肝衰竭。过量APAP常用于诱导急性肝损伤和肝衰竭动物模型。过量的APAP在肝内经CYP450酶氧化为高毒性N-乙酰对位苯醍亚胺(NAPQI)zNAPQI蓄积会造成肝细胞坏死。5)ConA(刀豆凝集素A)ConA是一种从白刀豆中分离的植物凝集素。凝集素是一种能与碳水化合物结合的蛋白质，-甘露糖和-半乳糖结构是ConA

6、的特异性结合结构。ConA是一种常见T细胞有丝分裂原，可以激活免疫系统，募集淋巴细胞并引发细胞因子的产生。主要激活CD4+T细胞，释放IFN-怵口TNF,诱发急性肝损伤。常用于构建自身免疫性肝炎(A1H)模型。2、异源血清I)HSA(人血清白蛋白)HSA鼠异源血清的主要成分，在人体内半衰期19天，常用于构建免疫反应诱导的慢性肝损伤模型。反复注射可导致典型的小鼠肝纤维化和大鼠肝硬化。大鼠HSA反复注射至肝硬化后联合D-GaIN+1PS用于造模AC1F,但是HSA注射诱导肝纤维化或硬化期间死亡率较高，限制了其应用。2)PS(猪血清)PS是另外一种鼠异源血清。猪血清腹腔注射诱导免疫介导的肝损伤模型相

7、比人血清白蛋白死亡率较低，用于模拟HBV感染或自身免疫肝病所致的慢性肝损伤或纤维化。病理上可见肝内单核细胞浸润和门管区周围纤维化,相比人血清白蛋白价格便宜和使用便捷。3、手术方式：BD1（胆管结扎术）一种模拟肝外胆道阻塞导致胆汁性肝硬化的经典手术模型，核心步骤是两端结扎大鼠或小鼠的胆总管并从中切断。高胆红素血症可增加促炎因子和促纤维化蛋白的表达，可很好的模拟肝脏炎症和纤维化，但是手术操作不易掌握，难于广泛应用且病程不可逆。三、模拟细菌感染的方法模拟细菌感染的方法包括三种： 细菌产物：1PS（细菌脂多糖）； 多重细菌：C1P（盲肠结扎穿孔术）、CS（盲肠泥）; 单一细菌：KP（肺炎克雷伯杆菌）、

8、E.Co1i（大肠杆菌）、S.Typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）。1、细菌产物1PS（细菌脂多糖）是所有革兰氏阴性菌外膜的主要成分,主要由三部分组成:脂质A（类毒素）、核心磷酸化的低聚糖、可变的特异长多糖链，是经典的PAMPso通过激活PRRS-T1R4/T1R2信号通路，是全身性炎症和感染性休克的强大介质。常与D-GaIN联合使用诱导急性肝损伤或肝衰竭模型，使用广泛且研究深入。2、多重细菌I）C1P（盲肠结扎穿孔术）C1P能模拟多重细菌感染,用于研究脓毒症和脓毒症相关多器官衰竭。是30多年来应用最广泛和最典型的实验性脓毒症模型。脓毒症严重程度可通过结扎的盲肠长度和盲肠穿刺针的尺寸来调节

9、,但是C1P模型的结果受限于操作者手术的一致性。2）CS（盲肠泥）因C1P模型主要受限于操作者手术的一致性，难以每次完全标准化，研究者发现小鼠盲肠泥注射也可模拟多重细菌感染。相比手术模型，盲肠泥注射一致性好，造模无需手术操作，单一盲肠泥供体可在大量动物中施用，简便易行。具有细菌定植、全身性炎症和剂量依赖性死亡率。是小鼠新生儿脓毒症研究的金标准模型。3、单一细菌构建全身性单一细菌感染模型可以通过腹腔注射一定剂量的细菌溶液，也可通过无创气管插管吸入细菌溶液。常用细菌有KP（肺炎克雷伯杆菌）、E.Co1i（大肠杆菌）和S.TyphimUriUm（鼠伤寒沙门氏菌）。四、已有慢加急性肝衰竭的动物模型1、

10、肝毒试剂诱导的AC1F模型1）CCI4+D-GaIN1PSCCI4联合D-GaIN1PS诱导AC1F的方法为CCI4,0.2-0.5m1kg,BiwTw,6-8周腹腔注射模拟慢性肝损伤及肝纤维化；D-GaIN,500mgkg,单用或联合1PS能模拟急性损伤;全身性炎症反应通过1PS（80gkg）注射模拟。该方式易于操作，能够模拟AC1F病程的核心临床表现，主要缺点是模型存活时间太短，不适合临床前的干预研究。2017年,有研究2利用CCI4+D-Ga1N/1PS给大鼠造模，结果显示AC1F组Th17细胞比例和IFN-Y水平均呈先升高后下降趋势。此外还观察到Treg细胞比例和I1-10水平的趋势逐

11、渐降低并趋于稳定，Treg细胞在AC1F的免疫机制中发挥了重要作用，在AC1F中Treg细胞的功能有缺陷。另有一项研究利用CCI4D-Ga1N/1PS为WiStar大鼠造模，结果显示肝组织和血清中细胞焦亡相关基因和蛋白的表达水平显著升高，细胞焦亡是AC1F发病的关键病理生理事件。HMGB1诱导的肝细胞焦亡会扩大炎症反应以加重Ae1F,抑制HMGB1可改善焦亡HMGB1,可能是AC1F治疗的潜在靶点3。2023年发表于JOUma1ofHePato1Ogy上的研究使用CCI4+1PS,CCI4D-Ga1N给C57B1/6小鼠造模,结果显示在1PS-AC1F模型中G-CSF注射死亡率明显增高(68%

12、vs0%,48h),G-CSF联合TAK-242(T1R4拮抗剂)可阻断死亡，明显降低肝细胞坏死、巨噬细胞浸润和炎症。在GaIN-AC1F模型中,G-CSF联合TAK-242降低肝损伤，促进肝再生，提示G-CSF联合T1R4拮抗剂在AC1F中可能具有减轻肝脏炎症和诱导肝再生的双重作用。2)TAA+1PSTAA在大鼠中的可诱导慢性肝损伤肝硬化,有典型的肝性脑病、凝血异常和肝内小叶中心坏死。SD大鼠腹腔注射TAA,250mgkg,Biw,Ww后加用1PS,1mg/kg可以模拟AC1FoTAA1PS操作容易，但文献中使用较少。一项研究利用TAA+1PSzCCI4+D-Ga1N/1PS为大鼠造模,研究

13、显示依诺肝素在1周、3周和预防性治疗显著降低了大鼠门静脉压力和纤维蛋白沉积，表明肝内微血栓形成减少。依诺肝素通过改善肝阻力增加的结构成分来降低肝硬化大鼠的门静脉压力提示依诺肝素在治疗/预防肝硬化门静脉血栓形成之外的潜在有益作用。3)CC4+APAP/1PSCC4+APAP/1PS造模的方法为CCI4,0.1-0.5m1kg,Biw,10w,使用C57B16小鼠;APAP,35Omgkg联合1PS,80gkgo可模拟进展性肝坏死、肝衰竭、肝再生抑制、门脉高压、多器官衰竭，仅有一篇报道，有待进一步验证。该研究利用CCI4+APAP/1PS为C57B16小鼠造模，结果显示CCI4APAP/1PS(C

14、A1PS)模型能模拟临床AC1F的生化和组织学特征，具有明显的进行性肝细胞坏死、肝功能衰竭、再生受损、门脉高压的进展和慢性肝病动物的器官功能障碍。2、免疫反应诱导的Ac1F模型HSAD-GAIN1PS常用于大鼠造模，是应用最早最广泛的AC1F模型。方法为HSA,8g1-NS,4mg皮下注射4次1.5月或4mg尾静脉注射，Biw6w;D-GaIN,400mgkg联合1PS,100ugkgo人血清白蛋白作为鼠异源血清主要成分，可以模拟免疫反应和自身免疫紊乱所致肝硬化。缺点是诱导肝硬化期间死亡率较高，超过20%动物模型存活时间较短，千预研究难以用生存率判断效果。一项研究7利用HSA+D-GaIN/1

15、PS为大鼠造模，结果显示抗TNF-建克隆抗体（TNF-O（抑制剂）和口比咯烷二硫代甲酸镇（PDTC,NF-KB抑制剂）可以分别用于治疗肝衰竭大鼠。在AC1F病程中抑制TNF-娓有益的，但NF-KB抑制不能保护AC1F大鼠。3、手术方式诱导的Ac1F模型1）BD1+1PSBD1+1PS的方式在大鼠、小鼠均有报道。BD1手术可以模拟高胆红素血症,导致肝纤维化或肝硬化，BD1造模后,加一次单剂量1PS（1mgkg）注射。近年来应用广泛。缺点是BD1手术后死亡率高，手术操作不易掌握,病程不可逆。一项研究8利用BD1+1PS为大鼠造模。结果显示在肝硬化大鼠中，给予1PS可以促进AC1F进展，加重慢性肝病

16、的并发症并缩短了生存时间。辛伐他;丁可增加肝窦功能，减少门脉高压以及炎症和氧化的标志物，可显著降低肝硬化大鼠肝组织中转氨酶、总胆红素和血氨的水平以及1PS介导的肝星状细胞活化，提示辛伐他汀可减轻AC1F大鼠1PS引起的炎症和肝损伤，可用于治疗晚期慢性肝病患者。2)BD1+HepaticIschemia/Reperfusion/PHx/C1PBD1+HepaticIschemia/Reperfusion/PHx/C1P是以BD1手术为基础模拟高胆红素血症造模肝纤维化或肝硬化。2周后联合手术方式所致肝损伤作为急性打击，常见手术肝损伤方式有缺血再灌注损伤、部分肝切除(PHX)和C1Po目前尚无BD1C1P的报道。该方式能模拟AC1F病理