下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识.docx

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1、下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识摘要近年来，宏基因组二代测序（mNGS）技术在下呼吸道感染（1RTI）病原诊断领域得到了广泛应用，国内临床医师在mNGS的临床应用方面已积累了一定的经验和证据。但mNGS在1RT1病原诊断中的适用场景仍缺乏规范，mNGS报告的临床意义解读也缺乏专业的指导意见。本共识基于mNGS在我国1RT1病原诊断方面的应用实践，梳理mNGS在1RT1应用领域的瓶颈问题，汇总本领域专家意见，明确了mNGS在1RT1病原诊断中的适用场景，为mNGS报告临床意义提供了一条合理可行的解读路径，以期规范mNGS在1RT1中科学合理应用。宏基因组二代测序是近年来兴起的

2、基于核酸检测的微生物鉴定技术，由于其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS技术本身存在的局限性，mNGS诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理的解读。尽管国内就mNGS的技术要点和临床应用已有数部专家共识，但尚缺乏针对1RTI临床实践中具体问题的指导意见。为此，中华医学会呼吸病学分会发起并组织呼吸与危重症、临床微生物检验、感染等多学科的专家撰写本共识，以期规范mNGS在1RT1中的临床应

3、用，为更好地规范解读mNGS报告提供指引。1RTI诊断要点、主要病原谱及特定致病微生物的危险因素本共识不再赘述，可参考相关指南或共识。本共识采用问答的形式，首先提出需要阐明的问题，经共识写作组讨论后确定入选问题，在梳理临床证据的基础上给出每个问题的推荐意见及理由，并附上典型应用案例及其解析，方便读者掌握共识要点。本共识适用于青少年和成人1RTIo一、1RTI病原学诊断方法学问题1：mNGS和传统微生物检测方法相比的优势与不足是什么？传统微生物检测方法技术成熟，可靠性较高，临床应用实践多；mNGS技术理论上能非预设性、一次性检测未知病原，检测范围更广，但存在技术复杂、报告解读困难等不足。与传统微

4、生物学检测方法相比。不同的病原学诊断方法都有其各自的适用场景与前提，需要根据患者群体、病情特点、可疑病原微生物类别、当地实验室条件，选择适宜检测方法。二、患者的选择问题2：哪些疑似1RTI的临床场景需考虑通过送检mNGS明确病原微生物？1.免疫抑制宿主疑似发生1RT1且临床表现提示非CAP常见病原微生物所致者。免疫抑制宿主包括原发性免疫抑制宿主、进展期恶性肿瘤患者或感染前1年内罹患恶性肿瘤患者（不含I期肺癌等早期恶性肿瘤或局限性皮肤癌）、正在接受化疗的恶性肿瘤患者、HIV感染伴CD4+T淋巴细胞计数200/u1、实体器官移植受者、造血干细胞移植患者、长期使用较大剂量糖皮质激素治疗患者（等效泼尼

5、松220mg/d且持续214d,或等效泼尼松累积剂量70On1g）、接受生物免疫调节剂治疗患者如抗肿瘤坏死因子（TNF）-单克隆抗体等、接受缓解病情抗风湿药或其他免疫抑制药物（如环抱素、环磷酰胺、甲氨蝶吟等）治疗的患者、各种原因导致的粒细胞缺乏患者（外周血中性粒细胞计数0.5X109/1）等。2 .1RT1患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；1RT1经规范经验性抗感染治疗4872h后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者。3 .聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的1RTI；有特殊病史（如近期境外或野外旅游史）

6、且经验性治疗无效，病情较为严重的1RTI；临床考虑特殊病原体（如钩端螺旋体、嗜肺军团菌、鹦鹉热衣原体等）感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时。4 .患者有1RTI症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致（如结缔组织疾病的肺部累及、肺淋巴瘤等），可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS以帮助鉴别诊断。问题3：哪些临床场景通常不建议送检mNGS?1 .免疫功能健全宿主罹患1RTI（包括重症肺炎），经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转。2 .1RTI已通过其他方法获得病原学结果，与

7、临床特点相符，或针对性治疗有效。3 .无法获取优质标本。问题4：如何根据所在医院微生物检测能力差异化送检mNGS诊断1RTI?mNGS技术本身具有价格昂贵、技术复杂、结果解读难度大的特点，不建议mNGS替代传统生物检测。在传统微生物检测能力不足的医疗单位，对于疑难、复杂或危重感染病例，可以考虑将mNGS作为传统的补充手段。原则上应首先针对可疑病原微生物选择可靠的检测方法，包括PCR等特异性的分子检测，但在缺乏相应检测手段的情况下，可将mNGS作为备选。例如，疑诊病毒性肺炎或非典型病原体肺炎患者，应首选针对常见呼吸道病毒和非典型病原体的PCR或多重PCR和（或）抗原检测，在常规检测阴性或本机构无

8、法进行相关检测时，可将mNGS作为重症患者的选择。三、标本选择、采集和运送规范及质量评估问题5：如何根据1RT1特点选择mNGS送检标本类型？在1RT1的病原微生物诊断中，可用于mNGS检测的标本包括痰（含诱导痰）、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液、经支气管肺活检标本、经支气管内超声活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。选择mNGS送检标本类型时应考虑下列因素：（1）标本中的病原微生物载量；（2）标本中污染或定植微生物的含量及其对检查结果的干扰；（3）标本中人源序列的含量及其对检测结果的干扰；（4）标本采集的难易程度及相关操作风险；（5）标本采集所需要的医疗费用。问题6：样本质量如何保证，标本保存

9、和运输条件是什么？1.保证mNGS送检标本质量的主要措施:mNGS在采集、运输、保存等多个环节易污染，影响结果判读。（1）选择高质量的呼吸道标本，标本采集时应尽量避免污染。（2）尽量由专门技术人员进行采集，可参考临床微生物分子检测规范，对医护人员进行采集运输微生物标本等方面的培训。（3）规范采集方法和送检流程：对于痰液标本采集，医护人员应首先判断患者是否有自主咳痰的能力，监督并协助患者,清水漱口23次,用力咳出深部痰35m1,保存在无菌杯内；若为气管插管患者，无法自主咳痰，可通过气管插管进行抽吸，留取标本在无菌杯内；BA1F标本采集，应在支气管镜的引导下，使用无菌生理盐水多次灌洗，留取510m

10、1标本放入无菌管中，尽快送至检测实验室；肺组织标本采集，应尽量对感染部位或边缘进行取材，保存在无菌杯中，尽快送至检测实验室。尽可能在首次抗菌药物使用或更改治疗方案前进行采集。尽量使用有螺口的无菌杯或使用封口膜进行密封，减少运输和保存过程中的污染。（4）信息标注完整：患者基本信息，临床症状（包括现病史和既往史等），标本采集时间、方法，抗菌药物使用种类及其持续时间，临床医生的初步诊断及对致病微生物的初步判断等。（5）针对不同的标本类型，制定标本接收或拒收标准。如合格的痰标本应白细胞25个/低倍视野，鳞状上皮细胞GO个/低倍视野，或白细胞/鳞状上皮细胞2.5；合格的BA1F标本鳞状上皮细胞应1%,镜

11、检现场评价有助于提高采样质量。实验室在接收到标本后，应尽快评估标本质量。对于不合格的标本，应与临床沟通后尽量重新采集。若重新采集难度较大，则在相应标本的检测结果中应明确标注标本质量不合格，在对该标本的测序结果进行判读时应考虑标本质量对检测结果的干扰。2 .NGS送检标本的保存要求：（1）下呼吸道标本：包括痰（含诱导痰）、BA1F,肺炎旁胸腔积液等，原则上应在采集后立即送检。若标本不能立即送检，标本采集时间与检测时间间隔24h,可在28。C保存。若标本采集时间与检测时间间隔24h,DNA测序标本保存时间W2周时可储存在-20OC冰箱，保存时间超过2周则需储存在-80。C冰箱；需要进行RNA测序的

12、标本如果保存时间24h,均应保存在-80。C冰箱。对于短期不做检测的液体样本，冻存前应分装保存在冻存管（25001管）中。（2）血标本：采集后4。C保存不超过8h,如果需要长期保存，分离血浆后4。C可保存24h,长期保存于-80。C冰箱。（3）组织标本：来自感染部位的穿刺或手术切除组织标本，应保存在无菌生理盐水或者Han1s液中，4OC保存不超过24h。如果需要长期保存，小块组织可以不加保存液立即-80OC冻存，穿刺活检标本置于无菌生理盐水-80OC冻存。3 .标本的运输要求：（1）24h内送抵实验室并开始检测，可考虑冰袋低温运输；（2）2472h内送抵应干冰运输，送抵后应立即进行标本前处理和

13、核酸提取。4 .需要进行去宿主核酸处理的标本保存和运输注意事项：除了上述注意事项外，此类标本一般要尽量保证病原微生物完整性，避免碾磨或多次冻融。问题7：哪些1RT1需要在进行DNA测序的同时送检RNA测序？RNA病毒引起的1RT1通常有一定的季节性、流行性或地域性。建议检测方法首选单重或多重PCR检测或相应的抗原检测。若当地医疗机构无相应检测能力，或PCR检测阴性但依然高度怀疑时,可在送检mNGSDNA测序的同时进行RNA测序。下列临床情况可供参考：（1）呼吸道RNA病毒感染流行季节（主要是冬春季节以及南方的夏季）、有相应流行病学史的患者出现疑似呼吸道病毒感染的临床和（或）影像表现。（2）1R

14、TI合并以下情况时：免疫抑制宿主；发热伴严重血小板减少或凝血功能障碍；急性肝肾功能损害；急性神经系统症状。四、mNGS的关键实验室技术参数问题8：mNGS检测报告需要关注哪些内容？mNGS检测报告从检测技术角度应包括如下内容：标准化后的微生物特异性读长（reads）数/序列数、标准化中英文名称、相对丰度、阈值、基因组覆盖度图。可选内容有：相应部位病原微生物列表、微生物序列与人源核酸序列的比值、测得总序列数、质量合格序列数、可比对至微生物数据库序列数、测序质控图、耐药基因、毒力基因等。报告微生物的版块可按细菌、病毒、真菌、寄生虫、特殊病原体（支原体、衣原体、立克次体等）5大类分别列举。主要参数定

15、义及其意义：（1） reads：测序仪单个测序反应所得到的碱基序列，二代测序平台一般长度为5075bp的片段。（2） reads数：指测序获得的某种微生物属/种碱基序列的数量。病原微生物属/种水平上检出的reads数与当次实验的总测序数据量直接相关，为避免总测序数据量高低的干扰，应对检出reads数进行标准化之后进行报告。（3）覆盖率：指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比。没有达到给定深度的部分称为盲隙（gap）o通常同时使用覆盖率和深度描述测序结果。覆盖度图采用病原全基因组模式图的形式，展示病原检出位点及检测次数的分布情况。测序深度指测序得到的碱基总量与基因组大小的比值，或

16、可理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。（4）相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物序列在相应5大类微生物类别中的分布比例。丰度越高，表示该微生物所占比例越高。它只能指示同一样本中某微生物的相对数量，不能用于不同样本之间的比较。（5） Q值：指质量分值，用于衡量测序准确度，公式为Q=-IO1og1OP,其中P代表该碱基被测序错误的概率。如Q20表示该碱基检测错误的概率为1%。（6） RPM：每一百万条测得序列包含的阳性reads数。（7） RPTM：每一千万条测得序列包含的阳性reads数。五、mNGS报告解读问题9：mNGS检测结果用于1RT1病原学诊断时应遵循何种流程和路径？1 .分析报告质量，判断结果可信程度：根据送检标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信。2 .对mNGS检测出的微生物进行分级：参照附表1判断mNGS检出的微生物为致病性微生