临床基因扩增诊断实验室工作规范(试行).docx

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1、附件2临床基因扩增（PCR）诊断试验室工作法律规范（试行）为使基因扩增诊断技术法律规范有效的用于临床，保证检测质量，更好地为临床疾病的诊疗服务，特制定本法律规范。1 .临床基因扩增试验室的设置：和仪器设施临床PCR试验室应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设施。即1）试剂贮存和预备区；2）标本制备区；3）扩增反应混合物配制和扩增区和的扩增产物分析区。如使用扩增和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动分析仪如Cobas-T（Anplicor）等，则3）和4）两个区可合并。与上述特定试验区有关的各个房间必需有明确的标记，以避开不同工作区内的设施物品如加样器、试剂等的移出或不同的

2、工作区间发生混淆。进入各个工作区必需遵循一严格的）挨次，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和预备区标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。不同的工作区必需使用不同的工作服，可以不同的颜色来区分。此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。1. 1.试剂贮存和预备区本区用于贮存溶液的制条、溶液的分装和主反应混合液的制各。本区仪器设施配置：（1）4冰箱和一 20冰柜；（2）混匀器；（3）微量加样器若干支（掩盖1lOOOpl）； （5）专用工作服和工作鞋；（6）专用办公用品；（7）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离。心管和加样器吸头（带滤心）；（8）可移动紫外

3、灯（近工作台面）。1. 2.标本制备区标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。RNA测定时的单键。cDNA合成也在本区进行。本区仪器设施自己置：（1） 4冰箱、一20或-70冰柜三（2）高达台式冷冻离心机；（3）混匀器；（4）水浴箱或加热模块；（5）微量如排器若干支（掩盖1lOOOul）； （6）专用工作服和工作鞋；（7）专用办公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（9）可移动紫外灯（近工作台面）；（10）超净工作台；（11）超声波水浴（处理大分子DNA适用）。1. 3.扩增反应混合物配制和扩增区模板材料（来自标本制备区）和主反应混合液（来自

4、试剂贮存和预备区）的加入以及扩增反应等特地在本二.作区内近行。本区仪器设施自己置：（1）核酸扩增仅三（2）微量加样器（掩盖l1000 Pl）；（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。2. 4.扩增产物分析区本区面积应为68m o扩增严物的分析在本区进行。本区仪器设施配置：视检测方法不同而定，如为PCR�ELISA,则需（1）微量加样器若干支（掩盖l-2s （2）酶标权、洗报机和恒温箱；（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办么，用品；（5）消耗品：次性手套、一次性吸水纸、

5、加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。2.临床基因扩增诊断试验室质量保证临床基因扩增诊断试验室质量保证涉及到整个基因扩增检测的全部阶段，即测定分析前的标原来集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。2. 1.标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或拘檬酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆.痰、脑普液、尿及分泌物等。采样容器最好是密闭的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用时无需进一步预处理。当使用非密闹采样系统时.，如尿、分泌物和骨髓的采禅,必需留意防止来自来样者的皮屑或分泌物的污染。采样者采样时起码要谈.一次性手套。可重复使用的玻璃器（应高压

6、处理，由于玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要来源是试验人员的手。最好是热灭菌，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必需进行抗凝处理。通常EDTA和拘檬酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，由于肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除肝素。临床用于RNA （如HCV RNA）测定的血标本最好进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分别血浆,以避开RNA的降解。如未作抗凝处理，则物血后，必需在1小时内分别血清。2. 2.标本的稳定化处DNA分析，标本采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应准时送到试验室。由于RNA易于降解，因此用于RNA测定的标

7、本的稳定化处理有时是必不行少的，Chaotropic物质特殊是异硫氨酸抓盐（Guanidine thiocyanate, GITC）可使DNAse和RNAse马上失活。在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆加入含有GITC的试剂管中进行稳定化处理。GITC可使RNAse不行逆失活的适合浓度为5molL0假如GITC浓度小于4mol / L； RNA会很快降解。在适当的稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。假如温度低于室温,GITC即会结晶，所以在加入标本前应使之完全溶解。如标本不能准时送到试验室，最好选用GITC处理方法以稳定标本。2. 3标本的运送标原来集后应尽快送至试验室，经过适当稳定

8、化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA提取的含EDTA的全血标本及用于RNA提取的经GITC稳定化处理的标木。是否冷藏取决于标本的用途，较长时间在室温贮存会导致灵敏度大大降低。通常应采纳不易破裂的容器装载标本。用于RNA检测的标本，假如在未经稳定化处理，则必需速冻后,放在干冰中运送。2. 4.标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-7（）下长时间贮存。用于DNA测定的核酸样本应在10mmol / L Tris, lmmol / L EDTA 缓冲液（pH 7. 5-8. 0）中 4 保存。用于 RNA 测定的核酸样本应在缓冲液中一 80 C或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在一

9、 20OC即可。用GIT （：稳定化处理的RNA标本在室温可保存7天，如贮存时间较长，则RNA测定敏感性略有下降。2. 5.标本的处理（核酸提取）核酸提取是打算扩增检测成败的关键性步骤。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中确.留的有机溶剂（如酚、氯份等），这些物质对其后的酶反应步骤具有剧烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。如在HBVDNA PCR测定中。采纳对血清杯水煮沸裂解以释放DNA的方法时，肉眼观看不明显的溶血也会对扩增测定有很强的抑制作用，应使用正规的核酸提取方法（如经典的酚一氯份提取方法、硅吸附法

10、等）。当标本为疾时，则必需先进行液化处理。再提取核酸。需留意的是；液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，降解是一个主要问题。RT-PCR测定失败的常见缘由是标本在运送前来经充分的稳定化处理.及核酸提取试剂的RNase的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，假如没.现RNA降解的证据。试验室则应拒绝接受标本，要求重新实行标本，并对运送者给以具体的指导。对于后者，建议常规使用高质量的商品核酸提取试剂。2. 6靶核酸的逆转录和扩增3. 6.1靶RNA的逆转录cDNA合成为RT-PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA为靶RNA的反向互补链。为后面扩增的模板。下述因素通常影

11、响cDNA合成的效率：1） RT活性的降低或完全缺乏。必需排解由于酶质量不高、试剂降解或加样错误而引起的cDNA合成不充分。2） RT或热稳定聚合酶的抑制物（如酚、血红素）。当RNA明显为完整而没有扩增时,应怀疑有此类抑制物。3） RNA的降解。2. 6. 2影响扩增的因素有多种因素可引起PCR的假阳性或假阴性结果，如抑制剂或酶活性丢失（见上）、迟大温度不对、晚十十浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。反应孔中热传导的均一性极为重要,循环仪的温度掌握和加热块中热传导的全都性必需有常规的检查以避开假阴性结果。2. 7污染在实际工作中，常见有以下几种污染类型：PCR片段的污染（产物污染）三自然 基因组

12、DNA的污染；试剂污染（贮存液或工作液）：以及交及污染（如气溶胶从一个阳性标本集中到原本阴性的标本）。对于全部的扩增技术，由于围绕试验室来查找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。一旦发生了污染，试验就必需停止，直到发觉了污染源为止。假如没有例外，试验结果必需作废，即使平行的污染质控中仅有一管显示出有PCR片段污染。2. 7. 1 .测定分析前的污染源。测定分析前试验材料的污染主要来自非病人标原来源的核酸。2. 7. 2.测定分析阶段的污染源。通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的试验设施的任何部位都是可能的污染源

13、。如受污染的试剂（例如今血清白蛋白，明腋成矿物油）；商品酶制剂；消耗品（如反应管，吸头）和试验设施（如加样器、离心机）。污染的来源之一是很多样本在同时制备时的交及污染，但最主要的污染来源为以前扩增产生的特异产物DNA片段。在前面三个工作区中，不当的试验操作会引起所使用的试剂、消耗品或试验设施的污染。而在产物分析区，当吸取PCR产物用于检测时，特别简单引起污染，因此必需制定并严格执行标准操作程序。2. 7. 3.污染的避开。要避开污染，首先应是预防而不是排解污染，前面所述工作区的严格划分的目的正是为了预防污染。为避开以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用dUTP取代

14、部分dTTP：从而产生的特异扩增片段含有尿喘咤，这样扩增前在反应混合液中加入尿喘陡糖激酶（UNG）,可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避开其对将要进行的扩增测定的污染。此外一种方法是持续的长波紫外灯照耀，通过异补骨脂素光化；单产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不阻碍PCR后杂交过程，所以这些方法也能防止污染。由于上面提到的方法会给人一种假的平安感，所以不能以其来替代严格的试验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的自然 DNA的污染。2. 7. 4.去除污染的措施。工作完后必需定期实行有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：

15、用100ml/L次氨酸钠清洁表面；试验了后长时间的紫外照耀试验操作台和其他表面；试验设施如加样器的高压消毒。2. 8.扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法。如电泳、限制性酶切、斑点印迹、杂交、测序、分光光度法定量等。但临床PCR测定项目基本上都使用探针杂交方法。2. 8. 1.与杂交检测有关的干扰。杂交结果不充分的缘由可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适。最常使用的基因探针有：DNA片段、合成的尊核普酸和体外的转录本（反义RNA探针）。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光景和同位素等。在扩增后的杂交检测中，应当严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性。还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高润度和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密掌握温度和试剂是避开假阳性和假阴性结果的先决条件，要留意的是，温度和离子强度不能同时转变。2. 9.质量掌握如上所述，应当开展各种质控来评价测定分析当中各步骤的质量，如RNA的完整性、对扩增是否合适和敏感。2. 9. 1.室内质量掌握必需对DNA和RNA分析的各步