RNA农药的研究现状和发展前景.docx

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1、基因干扰（RNAi）是一种在动物、植物和微生物中高度保守的基因表达调控工具。1998年zFire等首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditise1egans）中证明了触发基因沉默的关键因子是双链RNA（dsRNA）,而非单链RNAo具体而言,dsRNA被Dicer-Iike蛋白随机剪切成长度为2124nt的小RNA（siRNA或miRNA）,siRNA与Argonaute蛋白（AGOs）结合形成RNA诱导的沉默复合体（RISCs）,该复合体与目标RNA链互补，诱导mRNA降解或抑制翻译进程。利用RNAi技术靶向有害生物的必须基因，实现高效的基因沉默，可有效控制病虫害的发生。基于RNAi技术

2、创制的新型核酸农药被称为农药史上第三次革命，与传统化学农药相比，具有靶向性高、易降解、靶点丰富及可灵活设计等优势。目前，RNAi在植物病虫害防控领域的应用主要通过4种途径实现（图1）:（1）HIGS,即培育表达dsRNA的转基因植物以防治病虫害；（2）VIGS,即利用病毒或微生物表达和递送靶标生物dsRNA的方法；（3）SIGS,即创制喷洒型RNA农药,直接喷施于植物表面以控制病原菌和害虫；（4）NDGS,即利用纳米载体递送dsRNA以诱导靶标基因沉默的方法。H1GS外源dsRNAsiRNA沉默复合体jWmRNAQ内源mRNA降斛内体逃逸保妒&RNA；、邳fC森释放dsRNANDGS图1RNA

3、i在植物病虫害防控领域的4种应用策略示意图叶锹体正义链分离_dsRNAsiRNA细融核病愎菌害虫细电膜核酸除O正负电荷/rJH离了纳米就体/dsRNA复合物本文介绍了以RNAi为核心的病虫害防治技术的研究现状，分别论述了基于HIGS.VIGS、SIGS和NDGS策略的RNAi技术用于防治植物病虫害的应用实例及商业化情况，并对核转基因技术培育转基因作物和创制喷洒型RNA农药的瓶颈问题进行总结，点明了叶绿体介导的RNAi技术和纳米载体递送dsRNA策略的优势。dsRNA的合成成本、保护剂和载体制备工艺、转基因植物和载体的生物安全性评估，仍然是未来在研发和商业化生产中需要关注的问题。O1利用HIGS

4、策略防控病虫害1.1 核转基因技术的应用研究人员已成功实现利用转基因植物表达调控病虫害生长发育关键基因dsRNA,降低靶基因的表达量，导致靶标生物死亡或发育畸形，从而控制病虫害发展的策略。通过核转基因工程向细胞核导入外源基因的核基因转化技术是一种主要的HIGS策略。例如，在对咀嚼式器害虫的防治中，Zhu等报道了一种表达棉铃虫（He1icoverpaarmigera）蜕皮基因（ECR）dsRNA的转基因烟草，幼虫取食烟草后出现死亡和蜕皮缺陷的现象，从而提高了转基因烟草对害虫的抗性。在另一项报道中，Mamta等选择了害虫蜕皮必需的几丁质酶基因（HacHI）作为靶标，构建了表达dsRNA的转基因番茄

5、和烟草品系，取食转基因植物的棉铃虫表现出生长迟缓和高死亡率,蛹和成虫均出现了发育畸形的现象。在对刺吸式害虫的防治中，Co1eman等采用表达dsRack1,dsMpC002和dsMpPIntO2的转基因拟南芥饲喂蝇虫,虫体内的基因表达量降低70%,蝇虫的繁殖能力下降40%60%oMurtaza等通过转基因马铃薯表达蜥虫巨噬细胞抑制因子（MIF1）的dsRNA,诱导蛇虫基因沉默并导致死亡，不同转基因马铃薯品系对蛇虫基因沉默的效率为30%62%o在植物病害防控领域,Nowara等将靶向病原菌葡聚糖转移酶基因（GTF1/2）的dsRNA转入大麦和小麦中，有效抑制了真菌的生长，提高了大麦和小麦植株对病

6、原菌的抗性。在对土传病害的防治中,Zhang等报道了一种表达microRNA166和microRNA159的小RNA转基因棉花，靶向沉默大丽轮枝菌（Vertici11iumdah1iae）中的毒力基因和菌丝生长基因，提高了转基因棉花对大丽轮枝菌的抗性。Matho等构建了表达病原菌CgCOM1基因siRNA的转基因辣椒和番茄，其对炭疽病原菌分生泡子的萌发、胚管发育、菌丝形成和生长有抑制作用，增强了茄科作物对炭疽病的抗性。1.2 基于核转基因技术培育转基因作物的瓶颈虽然核转基因技术在防治病虫害领域取得了显著成果，但是传统核转基因技术表达的dsRNA会进入植物细胞质，被植物自身的DiCer酶识别和剪

7、切，导致dsRNA无法在细胞内稳定积累，难以被加工成有效的siRNA,影响了对靶标生物的RNAi效率和防控效果，导致转基因作物的抗虫效果不明显。以叶绿体基因组作为遗传操作平台的叶绿体(质体)基因工程技术克服了核转基因技术中的缺陷，拓宽了植物基因工程在防治病虫害领域的应用。1.3 叶绿体转基因技术的应用植物细胞中质体基因组的拷贝数可达1万，且缺乏RNAi机制，使得质体转基因技术成为表达dsRNA的理想工具。近年来，相比于核转基因技术，叶绿体基因工程的优势逐渐显现，如减少了核转基因技术对植物生长发育的影响；在叶绿体中能稳定积累dsRNA以避免进入植物自身的RNAi系统等，这使得叶绿体转基因技术成为

8、植物基因工程的一个新研究热点。Zhang等报道了一种马铃薯质体基因组表达dsACT的方法，可用于马铃薯甲虫(1ePtinOtarSadecem1ineata)的防控。由于质体中积累了丰富的dsRNA,且维持了dsRNA的完整性使得质体转基因技术诱导的RNAi效率比核转基因技术更高。最近，Zhang等报道了能够表达dsRNA或发夹RNA(hpRNA)的转基因马铃薯，用于防治茄二十八星瓢虫(Henosepi1achnaVigintioctopunctata)。与核转基因技术相比，叶绿体介导的RNAi不会影响转基因马铃薯叶片的正常发育和形貌，且在害虫取食叶片后，幼虫的死亡率更高，有效减少了茄二十八星

9、瓢虫对茄科作物的危害。在另一项报道中，Wu等分别通过核转基因技术和叶绿体转基因技术培育了表达西花蓟马(Frank1inie11aOccidenta1is)-actinxTubu1in.V-ATPase和Snf7基因dsRNA的转基因植物,发现利用叶绿体转基因技术的dsRNA表达量比核转基因技术更多，提高了西花蓟马的致死率，为植物提供了更有效的保护，但基于叶绿体转基因技术对西花蓟马、桃螃(Myzuspersicae)和烟粉虱(Bemisiatabaci)等农业害虫的防治效率并不相同,可能与不同物种间的摄食习惯以及对RNAi的敏感程度存在差异有关。目前，叶绿体介导的RNAi技术在防治植物病害方面的

10、研究较少，但有一些基于叶绿体转基因技术表达抗菌蛋白，用于提高植物抗病性的研究，如Degray等报道了一种表达抗菌肽的转基因烟草，其叶片及叶片提取物均对真菌的生长和发育有抑制作用。02利用VIGS策略防控病虫害在农业领域，利用VIGS策略不仅能够改善农艺性状，还能防治病虫害，为作物提供保护。病毒是VIGS策略中的主要载体，由于病毒独特的侵染机制，能有效帮助dsRNA逃脱生物体的物理和生理屏障，在寄主体内实现dsRNA的高效递送。例如，Taning等对昆虫单链RNA病毒进行修饰，用于表达黑腹果蝇(Drosophi1ame1anogaster)特异性的dsRNA,从而促进了昆虫吸收dsRNA的能力。

11、此外利用微生物表达和递送dsRNA的方法也被归属于VIGS策略。例如，采用能产生dsRNA的大肠杆菌(Escherichiaco1i)喂养昆虫，不仅可以避免dsRNA被昆虫消化系统中的酶降解，还能实现dsRNA的可持续供应。此外，利用共生菌产生害虫特异性的dsRNA,是一种无创伤递送dsRNA的方法,适用于多种靶标害虫。当靶标害虫摄入共生细菌后，细菌能在害虫体内持续增殖，保障充足的dsRNA,实现可持续的基因沉默。在植物病害防治应用中，Is1am等报道了一种基于微细胞递送的dsRNA策略，用于防治灰霉病。由微细胞同时递送多个dsRNA比单一dsRNA的RNAi效率更高，对灰葡萄泡的生长具有更高

12、的抑制活性，但利用病毒或微生物作为表达和递送的载体，在实际应用中存在传播病原物的风险。03利用SIGS策略防控病虫害研究人员对喷洒型RNA农药防治农业病虫害进行了广泛的试验，证明SIGS是一种具有潜力的非转基因RNAi策略。SIGS策略比HIGS策略在病虫害防治中具有更广阔的应用前景。例如，喷洒型的RNA农药研发成本低，周期较短，应用场景多且无需面临严格的市场监管和登记审查。当dsRNA能够廉价、大规模地生产时，喷洒型RNA农药将是防治病虫害的理想药剂。例如，ChakrabOrty等将针对烟粉虱hsp70基因的dsRNA药剂直接喷洒于辣椒植株上f烟粉虱取食后死亡率为67.7%,成功诱导了烟粉虱

13、中靶基因的沉默，且减少了虫体内病毒的数量从而使病毒病在辣椒植株中的传播效率降低了75%o针对另一种传播病原微生物的害虫,Ki11iny等在体外直接喷洒靶向柑橘木虱(Dbphorinacitri)抗性代谢基因(p450)的dsRNAo该dsRNA药剂能穿透害虫的角质层并成功诱导RNAi,提升了害虫对化学杀虫药剂的敏感水平。在植物病害防治领域，Wang等直接在水果、蔬菜和花卉叶面喷洒靶向灰葡萄抱(Botrytiscinerea)DC11和DC12基因的dsRNA,成功诱导了灰葡萄抱中靶基因的沉默，有效抑制了灰葡萄抱的生长和分生泡子的形成，提升了采后果蔬对灰葡萄泡的抗性。DUaniS-Assaf等以

14、灰葡萄泡的菌膜合成基因为靶标,合成了喷洒型dsERG1.dsERG11和dsERG13药剂，显著抑制了果蔬表面灰葡萄抱分生泡子的萌发和胚管的伸长。在对另一种气传病害的防治中，Sarkar等将针对稻瘟病原的dsMoDES1药剂直接喷洒于植物表面，病原菌的靶基因表达量降低了35%,减少了叶片表面病原菌的丰度，抑制了病原菌的生长和分生泡子的形成。04利用NDGS策略防控病虫害4.1 创制喷洒型RNA农药的瓶颈喷洒型RNA农药在植物表面能直接被昆虫或病原微生物吸收，诱导有害生物靶标基因的沉默。在实际生产应用中，喷洒型RNA农药受诸多环境因素限制。有研究报道，直接喷施的dsRNA暴露于空气中会被核酸酶和

15、紫外线降解，而在自然环境中，雨水冲刷和气流变化会直接影响植物叶面dsRNA的积累量，导致无法触发有效的RNAi反应。昆虫或病原微生物内部的核酸酶和PH环境都会影响dsRNA的稳定性，严重影响了RNA农药在有害生物体内的干扰效率。止匕外，昆虫的体壁和微生物的细胞壁是阻碍dsRNA摄入的主要物理屏障，降低了喷洒型RNA农药的递送效率。Qiao等发现多种致病性病原菌对dsRNA的摄取效率不同，导致不同病原菌对RNAi的敏感性存在差异。例如，疫霉吸收dsRNA的能力非常有限，炭疽菌则不能直接吸收dsRNA,而有益真菌绿色木霉吸收dsRNA的能力较弱。因此，研发纳米载体保护和递送dsRNA来克服喷洒型R

16、NA农药应用瓶颈已成为前沿热点。4.2 纳米载体对dsRNA的保护由于dsRNA被植物吸收不是一个瞬时的过程，有延迟效应，喷洒型RNA农药在田间的应用效率与dsRNA在环境中的稳定性密切相关。高效的RNAi依赖于充足的dsRNA,但实际应用中诸多因素会影响dsRNA在植物表面的积累。基于纳米载体的递送策略能高效保护dsRNA,提升dsRNA在工作环境下的稳定性。纳米载体不仅能增加dsRNA在叶面的滞留量，减少因喷雾飘移而造成的损失还能保护dsRNA免受核酸酶降解和生物体内PH微环境的影响，提高dsRNA在生物体内的稳定性。有研究报道以生物黏土作为dsRNA的递送载体，发现其能够减少dsRNA因冲淋而产生的流失,提升了RNAi效率，延长了植物对病毒病的抗性周期。在另一项报道中，阳离子聚合物作为dsRNA的递送载体，在昆虫高碱性的肠道环境中为dsRNA提供了保护,提升了甜菜夜蛾(Spodopterae