羊小反刍兽疫病毒PPRV酶联免疫分析ELISA试剂盒使用说明书.docx

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1、羊小反刍兽疫病毒（PPRV）酶联免疫分析（E1ISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定羊血清，血浆及相关液体样本中小反刍兽疫病毒（PPRV）含量。实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中羊小反刍兽疫病毒（PPRV）水平。用纯化的羊小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入小反刍兽疫病毒（PPRV）,再与HRP标记的小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的羊小反刍兽疫病毒（PPRV）

2、呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中羊小反刍兽疫病毒（PPRV）浓度。试剂盒组成:试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1X481X9628保存标准品：360ng10.5m1X1瓶0.5m1X1瓶2-8保存标准品稀释液1.5m1X1瓶1.5m1X1瓶2-8C保存酎标试剂3m11瓶6m11瓶2-8。C保存样品稀释液3m11瓶6m11瓶2-8保存显色剂A液3m11瓶6m1I瓶2-8保存显色剂B液3m11瓶6m1I瓶2-8保存终止液3m1X1瓶6m11瓶2-8保存浓缩洗涤液20m1X1瓶（20

3、倍）20m1X1瓶（30倍）2-8保存样本处理及要求：I.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2 .血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3 .尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4 .细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-

4、3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到IOO万/m1左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5 .组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8C的温度。加入一定量的PBS（PH7.4）,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）,仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6 .标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行

5、，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融.7 .不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1 .标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品1001,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液501,混匀；然后从第一孔、第二孔中各取1001分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液501混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取501弃掉，再各取501分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50u1,混匀；混匀后从第五、第六孔中各取501分别加到第七、第八孔

6、中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液501混匀后从第七、第八孔中分别取501加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液501,混匀后从第九第十孔中各取501弃掉。（稀释后各孔加样量都为501,浓度分别为240ng1,I60ng1,80ng1,40ng1,20ng1）2 .加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液401,然后再加待测样品101（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3 .温育：用封板膜封板后置37C温育30分钟。4 .配液：将30（48T的2

7、0倍）倍浓缩洗涤液用蒸储水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5 .洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重第5次，拍干。6 .加酶：每孔加入酶标试剂501,空白孔除外。7 .温育：操作同3。8 .洗涤：操作同5。9 .显色：每孔先加入显色剂A501,再加入显色剂B501,轻轻震荡混匀，37C避光显色15分钟.10 .终止：每孔加终止液501,终止反应（此时蓝色立转黄色）。11 .测定：以空白空调零，45Onm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项：12 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，

8、前标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。13 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。14 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。15 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（XnX5）。16 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。17 底物请避光保存。18 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.19 所有样品

9、，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。20 本试剂不同批号组分不得混用。21 .如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。试剂盒性能：1 .样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。2 .批内与批见应分别小于9%和11%检测范围：9ng1-320ng1保存条件及有效期：1 .试剂盒保存：；2-8oCo2 .有效期：6个月GoatP

10、PRVFORRESEARCHUSEON1YDrugNamesGenericName：GoatPPRVE1ISAKit.PurposeThiskita11owsforthedeterminationofPPRVconcentrationsinGoatserum,b1oodp1asma,andotherbio1ogica1f1uids.Princip1eoftheassayThekitassayPPRV1eve1inthesamp1e,usePurifiedPPRVantibodytocoatmicrotiterp1atewe11s,makeso1id-phaseantibody,thenaddP

11、PRVtowe11s,CombinedPPRVantibodywhichWithHRP1abe1ed,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomp1ex,afterwashingComp1ete1y,AddTMBsubstrateso1ution,TMBsubstratebecomesb1ueco1orAtHRPenzyme-cata1yzed,reactionisterminatedbytheadditionofasu1phuricacidso1utionandtheco1orchangeismeasuredSpectrophotometrica11y

12、atawave1engthof450nm.TheconcentrationofGoatPPRVinthesamp1esisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamp1estothestandardcurve.Materia1sprovidedwiththekitMateria1sprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanua111C1osurep1atemembrane22Sea1edbags11Microe1isastripp1ate112-8Standard：360

13、ng10.5m11bott1e0.5m11bott1e2-8Standarddi1uent1.5m11bott1e1.5m11bott1e2-8cHRP-Conjugatereagent3m11bott1e6m11bott1e2-8CSamp1edi1uent3m11bott1e6m11bott1e2-8ChromogenSo1utionA3m11bott1e6m11bott1e2-8ChromogenSo1utionB3m11bott1e6m11bott1e2-8StopSo1ution3m11bott1e6m11bott1e2-8washso1ution2020m11bott1e3020m

14、11bott1e2-8CSpecimenrequirements1. serum-coagu1ationatroomtemperature10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifuga1again.2. p1asma-usesuitedEDTAorcitratep1asmaasananticoagu1ant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m

15、.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifuga1again.3. Urine-co11ectsueasteri1econtainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifuga1again.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospina1f1uidReferencetoit.4. ce11cu1turesupernatant-detectsecretorycomponents,co11ectsueasteri1econtainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.