DB51T 2310-2016 副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌双重PCR鉴别诊断技.docx

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1、ICS65.020.30B41DB51四川省地方标准DB51/T23102016副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌双重PCR检测方法2016-12-20发布2017-01-01实施四川省质量技术监督局前言II1范围12规范性引用文件13 术语和定义14 设备和试剂15 DNA提取26 PCR扩增37 PCR产物的电泳检测38 结果判定39废弃物处理3附录A（规范性附录）相关试剂配制4本标准附录A为规范性附录。本标准依据GB/T1.1-2009给出的规定进行编写。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：西南民族大学。本标准主要起草人：张斌、岳华、汤承

2、、杨发龙、张焕容、任玉鹏和王远微。副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌双重PCR检测方法1范围本标准规定了副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的双重PCR检测方法。本标准适用于副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注H期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程兽医实验室生物安全技术管理规范(2003农业部公告第302号)3术语和定义本标准采用下列术语和定义

3、。3.1副猪嗜血杆菌(Haemophi1usparasuis,HPS)副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定的条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征革拉泽氏病(GssersDisease)o3.2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(ACtinbaci11usp1europneumoniae,APP)猪胸膜肺炎放线杆菌是猪传染性胸膜肺炎的致病菌，以急性出血和慢性纤维素性坏死性胸膜炎病变为主要特征。3.3双重PCR是在同一反应体系中同时加入多对引物，这样可同时扩增出两种不同特异性靶基因序列片段，依据这一特性，在同一反应体系中同时对两种病原的特异性靶基因序

4、列标志进行扩增，即可达到同时鉴定两种病原的目的。4设备和试剂4.1主要仪器和设备4.1.1PCR扩增仪。4. 1.2电泳仪、水平电泳槽。5. 1.3凝胶成像系统。6. 1.4离心机。7. 1.5微量高速离心机（适合于对PCR反应管进行离心操作）。8. 1.6高压灭菌锅。9. 1.7恒温水浴锅。10. .8移液器。11. 2主要试剂12. 2.1引物（10mo11）：a） HPS-F-GTGTGGGAAGGGTGGTGT;HPS-R-TCTCTACGCCGATCTTGTAT；b） APP-F-ATACGGTTAATGGCGGTAATGG；APP-R-ACCTGAGTGCTCACCAACG；c）引

5、物扩增出两个片段大小分别为822bp（HPS）和346bp（APP）。4.2.2DNA提取试剂：蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、TriS酚、氯仿、异戊醉、无水乙醇。4.2.3PCR反应试剂：TaqDNA聚合3（5U1）MgC12（25mno11）、dNTP（每种浓度为2.5rano1/1）、10PCRBuffer（无Mg2+）。4.2.4STE缓冲液（见附录A）4.2.5TAE电泳缓冲液（见附录A）.4.2.66x上样缓冲液（61oac1ingBuffer）。4.2.7琼脂糖（电泳级）。4.2.8核酸染料（GoIdView）。4.2.9D12000bpDNAMarker.4.2.10水：所

6、用水应符合GB/T6682中三级水（三蒸水）规格。4.2.11阳性对照：HPS血清5型Nasagaki菌株和APP血清2型CVCC260菌株的灭活菌液作为阳性对照。4.2.12无模板对照：用三蒸水作为无模板对照。5DNA提取5.1样本处理5.1.1组织样本：肺等组织样本，按Ig加入Im1的STE,剪碎并研磨，3000r/min进行离心10min,取上清液，12000r/min进行离心20min,弃上清，沉淀用于DNA提取。5.1.2胸腔渗出液：取5001胸腔渗出液，加入5001STE缓冲液，混匀，12000r/min离心20min,弃上清，收集沉淀用于DNA提取。5.1.3液体培养物：5001

7、培养物12000r/min离心20min,弃上清，收集沉淀用于DNA提取。5.1.4阳性对照：提取HPS血清5型NaSagaki菌株和APP血清2型CVCC260菌株的灭活菌液的核酸作为阳性对照。5.2DNA提取方法5.2.1向上述沉淀中加入5001STE缓冲液，使其重悬。5.2.2 加入10$SDS溶液201,20mgm1蛋白酶K101,混匀，在56水浴60min。5.2.3 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合液，混匀，12000r/min离心5mino5.2.4转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，颠倒混匀，12000r/min离心5min5.

8、2.5 取上清，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20沉淀30min,12000r/min离心5min,弃去上清液。5.2.6 用Im170%乙醇漂洗，12000r/min离心5min,弃上清液。5.2.7 室温干燥，DNA沉淀用251无菌三蒸水溶解作为模板，-20保存备用。6 PCR扩增每次进行PCR扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和无模板对照。PCR反应总反应体系251,包括以下成份：Taq0.21,IOxbuffer2.51,MgCh21,dNTP2u1,HPS-F11,HPS-R11,APP-F11,APP-R11,模板DNA100ng,dd2012.81oPCR反应条件为95C预变

9、性5min,然后进行95C30s,60eC30s,72C1Inin的循环，进行35个循环，最后72延伸10min,4保存。7 PCR产物的电泳检测用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖凝胶（见附录A）o取51PCR产物与116x上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入DNA分子量标准，以5V/cm恒压电泳，采用凝胶成像系统或紫外光透射系统进行观察。8结果判定8.1阳性对照出现两条电泳条带，约80ObP的条带为HPS,约300bp的条带为APP,无模板空白对照不出现条带。8.2在满足8.1的条件下，被检样品的PCR产物经电泳后出现两条约800bp和300bp的条带判定为HPS和APP核酸

10、阳性（+）；被检样品的PCR产物经电泳后只出现800bp的条带判定为HPS阳性（+）。被检样品的PCR产物经电泳后只出现约300bp的条带判定为APP阳性（+）o被检样品的PCR产物经电泳后不出现条带判定为核酸阴性。9废弃物处理按GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程，以及兽医实验室生物安全技术管理规范（2003农业部公告第302号）处理。废弃物实行无害化处理。附录A（规范性附录）相关试剂配制A.1STE缓冲液0.1mo1/1NaC110 mmo1/1Tris.HC1(pH8.0)11 mmo1/1EDTA(pH8.0)A.2TAE电泳缓冲液(pH8.0)50XTAE电泳缓冲液贮存液：TriS碱242gEDTA37.2g冰乙酸57.1m1加双蒸水至IooOm1,应用前用双蒸水将50XTAE电泳缓冲液进行50倍稀释。A.31%的琼脂糖电泳凝胶板制备琼脂糖1gIXTAE电泳缓冲液100m1将琼脂糖放入TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60C左右时加入51的核酸染料，混匀，均匀倒板，厚度为3mm-5mm。