校正因子的定义与测定方法.docx

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1、校正因子的定义与测定方法概述：标准物质一直是药品质量控制特别是纯度和含量分析的首选，但标准物质的供需矛盾，如有 些杂质标准物质不易获取以及多个标准物质同时使用所带来的高昂检测成本等限制了标准 物质的实际应用。为解决这一问题，替代方法应运而生，高效液相色谱(HPLC)校正因子法便 是其中之一。该方法最初主要用于HPLC有关物质检查时对于特定杂质的定量，进而又逐渐用于中药多指 标含量的测定，发展至今己经成为一项成熟的分析方法.一定义在HPLC法定量测定中，通常所讲的校正因子是某物质i与所选定的参照物质S的绝对校正 因子之比，即相对校正因子，其计算公式如公式(I)e校正因子在各国药典中均有应用，只

2、是表述方式不尽相同。中国药典与欧洲药典(EPIO.0)基本一致，使用校正因子(correction factor)的概念，差 别在于国内要求当已知杂质对主成分的相对校正因子在0.9l.l内时,可以用主成分自身对 照法计算杂质的含量,超出这个范围时宜用杂质对照品或者加校正因子的主成分自身对照法 计算杂质的含量；而EP10.0中则规定校正因子在0.81.2时仍可使用主成分对照法计算杂 质含量。美国药典(USP)中给出了相对响应因子(relativeresponse factor)的概念，从其各论中具体 计算方法可以推导出相对响应因子与相对校正因子是互为倒数的关系，在使用时需要注意将 待测峰面积(A

3、)与校正因子相乘或与相对响应因子相除以校正峰面积。,C待测物/待测物/八/ = -” (1)C参比物/“参比物c为待测物和参比物溶液浓度另外校正因子的使用也有一定的范围，如校正因子在0.25.0的范围以外时，表明杂质与 主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测 条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为 参照物质(如对照品易于获得、标准己采用对照品外标法定量的另一特定杂质)，重新确立校 正因子;如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当方法定量。二测定方法HPLC-UV/PDA 方法单点法制备适

4、当浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，按 照公式1计算得到校正因子。该方法的优点是操作简单，但由于无法排除样品处理或者检 测过程所引入的偶然误差，且没有考虑到样品浓度对测定结果的影响等因素，因此该方法主 要用于预实验时粗略的估计实验结果，在校正因子定值时实际应用较少。多点法制备适当的高、中、低三水平浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液，如果是加校正 因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限 度，分别注入液相色谱仪进样测定，按照公式1计算得到多个校正因子值，求取平均值作为 校正因子。目前该测定方法在中药多指标对照品替代

5、测定中应用较为广泛，但在杂质含量确 定方面应用较少。标准曲线法目前，校正因子的测定最常用的方法还是标准曲线测定法。具体操作如下：精密称取待测物对照品和参比物对照品各适量，分别配制成不同浓度的系列溶液，如果是加 校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标 准限度，分别注入液相色谱仪进样测定，以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，分别绘制 参比物和待测物标准曲线A=kc+b,当b=0时，可以推导出两者的相对校正因子为二者斜率k 之比，即公式（2）：，=人参比物/%待测物（2）其中k分别为参比物和待测物标准曲线的斜率。联立方程法前述3种HPLC方法使用的前提就是待

6、测物和参比物最好备有色谱纯的化学试剂或标准物质, 即使没有色谱纯，也要确知物质的百分含量。但在药物研发的早期，很难得到己知杂质的纯 品，因此，YU提出了一种无纯样色谱校正因子的测定方法。根据校正因子与峰面积成正比（校正因子是常数的条件）的前提，设一 “标”样仅含A、B二 组分且都出峰，各组分的量之和为一定值（如A、B两组分含量之和为100%）,因而可建立各 组分的量之和与校正因子、峰面积三者之关联式，另一 “标”样亦仅含A、B二组分，但峰 面积有差异（即二组分含量有异），同样可建立三者关联式，解两个关联式即可得各组分校正 因子。由此推论有几个组分就要建立相应个数的关联式求解而得到各组分的校正因

7、子。该方法为早期检测研发中带有多个未知校正因子组分的样品提供了一个新的解决思路,但是 受早期研发样品中可能还含有很多未知杂质等因素的限制，目前可以检索到该方法的实际应 用较少。紫外吸光系数比值法结合文献，Xu等首次推导出了公式（3）,证明了两物质的相对校正因子是两者的百分吸光 系数（E）之比。/=E待测物/ E参比物（3）因此可按吸光系数测定的相关技术要求,如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、 吸光度介于030.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备 测定、同台仪器2份供试液的平行测定结果不超过0.5%等，以流动相为溶剂，测定待测物 和参比物在检测波长处的紫

8、外吸收系数El%lcm,计算比值，求得校正因子.HPLC联用其他方法HPLC-UV/PDA串联其他检测器方法为解决HPLC-UV/PDA检测器方法有时很难获得待测物和参比物标准物质的难题，有研究者 提出通用型质量检测器技术与PDA或UV检测器串联以确定校正因子的方法。这种通用型质 量检测器产生的峰面积与相应的进入检测器的分析物的量成正比关系，而与分析物的结构特 性无关，从而可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系，再结合UV/PDA检 测器得到的峰面积，由公式(1)可推导出待测物相对于参比物的校正因子，如公式(4)所 示：AIA/71待测物UV峰面枳待测物质证型检测器峰面积zlf =

9、 J% (4)参比物UV峰面积参比物质垃型检测器峰面积在药物早期研发过程中使用此方法可以快速方便的测定特定杂质的相对响应因子，不需要 进行杂质的分离纯化，也不需要杂质标准品，甚至可以不需要知道分析物的浓度。目前可与紫外检测器串联测定相对校正因子的通用型质量检测器主要有蒸发光散射检测器 (ELSD),电喷雾检测器(CAD)、化学发光氮检测器(CLND)、示差折光检测器(Rl)等。其中ELSD、 CAD,其检测的峰面积与进入检测器的分析物的质量成正比关系；CLND检测的峰面积与分 析物中含氮的摩尔数成正比关系。通过这些信息可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系，再结合紫外吸收检 测器得

10、到的待测物与参比物峰面积，可计算出特定杂质相对于参比物的校正因子。目前仅检 索到国外的相关研究工作，未见国内相关报道。HPLC-UV/PDA检测器结合核磁定量方法虽然紫外检测器与通用型质量检测器串联的HPLC法在测定杂质相对校正因子时方便、快速， 但这些通用型的质量检测器都各有局限性。如ELSD受精密度、线性动态范围、需要挥发性流动相等因素的局限，且ELSD的响应取决于 探测器中发生的去溶剂化过程所产生的粒子的数量和性质；CLND只能测定含氮化合物，但 不能够测定结构中包含一N二N一和一NN结构的化合物，也不能够用含氮的流动相、流 动相中不能有非挥发性的缓冲盐；CAD的流动相中也不能有非挥发性

11、的缓冲盐，而且只适用 于在电喷雾电离条件下能够携带电荷的化合物，Rl受灵敏度、重现性等问题限制且不能用于 梯度洗脱。NMR除具备检测器串联HPLC法的优点外，不受上述检测器的流动相、缓冲液等色谱条件的 限制，q-lH-NMR检测的峰面积与分析物中相应的氢的摩尔数成正比关系，可以作为含有质 子的化合物测定相对校正因子的通用质量型检测器,但前提是该化合物可溶解在合适的笊代 溶剂中。于是Webster等建立了 HPLC-UV q-lH-NMR结合的方法测定特定杂质的相对响应 因子(RRF)的方法。IH-NMR检测的峰面积与分析物中相应的氢的摩尔数成正比关系，所以相对响应因子的计算 公式如下：NUVzNMRmNHRRFUV= 待测物工,参比物 /，参比物X Z侍测物代、7uv- /NMRTTh-1 “参比物,待测物r待测物,V参比物其中AUV为紫外检测器的相应峰面积；INMR为NMR谱图中相应氢的积分值；Mr为相对分 子质量；NH为化合物结构中用于积分计算的相应的氢的个数