异鼠李素对黑色素瘤细胞凋亡的影响分析.docx

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1、异鼠李素对黑色素瘤细胞凋亡的影响分析摘要：黑色素细胞瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤, 恶性程度高，目前尚无有效的治疗方法。异鼠李素（Zss加）作为广泛存在于 自然界中的一种黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化等生物活性， 细胞毒性较低，可应用于肿瘤、心血管疾病防治等诸多方面。因此，本文通过细 胞培养、HOeChSt和TUNEL凋亡染色，就异鼠李素对小鼠黑色素瘤细胞凋亡的 影响展开研究,发现异鼠李素能诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡，引起核DNA断裂， 染色质凝聚，形成凋亡小体，为揭示异鼠李素对黑色素瘤细胞凋亡调控机制研究 奠定基础。关键词：异鼠李素；小鼠B16黑色素瘤细

2、胞；凋亡1实验背景与目的黑色素瘤通常是指恶性黑色素瘤（mHig助mm）,它主要来源于皮肤、 粘膜、眼和中枢神经系统，由于这些区域的黑色素细胞聚集堆积，从而发展为高 度的恶性肿瘤，其最主要的发生部位是皮肤，然而正常皮肤的黑色素细胞转化成 黑色素瘤细胞的作用机制还不明确。目前的研究认为，皮肤黑色素瘤的发病机制 是多因素、多步骤共同作用的结果，其发生发展的过程涉及一系列抑癌基因比如 说Rb、P53、P16等的改变。根据临床表现和病理组织学，常见病理类型有：（1） 浅表扩散型黑素瘤；（2）结节型黑素瘤；（3）恶性雀斑痣样黑色素瘤；（4）肢端 雀斑痣样黑素瘤。近年来，恶性黑色素瘤在所有癌症中发病的增长率

3、最高，而且 容易发生转移，病情发展的速度较快，预后较差，最后导致死亡率相对较高，至 今没有治疗黑色素瘤较好的药物。近年来大量的实验研究表明：中药具有诱导肿瘤细胞调亡的作用，通过中药 的某个有效成分来激活体内的抗肿瘤基因或者引起促调亡基因的表达，寻找相关 蛋白基因的通路使肿瘤细胞的周期发生阻滞，从而阻断细胞从一个时期向另一个 时期进行转换，最终达到抑制其增殖，诱导其调亡的目的。已有研究表明，异鼠李素在体外对一些肿瘤细胞如LeWiS鼠肺癌细胞、人肝 癌细胞BEL-7402.人食管细胞系氏a-109等具有细胞毒性，可抑制癌细胞增殖， 引起肿瘤细胞凋亡。目前对异鼠李素对肿瘤细胞的凋亡机理的研究报道较少

4、，主 要报道为通过p53信号途径和线粒体介导的caspase凋亡通路发挥作用。但是异 鼠李素对黑色素瘤细胞的凋亡的影响及机理研究在国内外均未见报道。因此，本研究旨在已有研究工作的基础上，通过分子和细胞学实验，研究异 鼠李素对黑色素瘤细胞凋亡的影响,揭示其抑制B16黑色素瘤细胞增殖的机制， 建立用B16黑色素瘤细胞和酪氨酸酶来筛选和验证皮肤治疗药物的研究模型， 为人类相关皮肤疾病的认识提供新的思路。2实验材料和仪器2.1 实验材料小鼠B16黑色素瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。2.2 主要试剂DMSO (Am%seo,USA) PBS (Hyclone) 0.25%胰蛋白酶消化液

5、(Hyclone) DEME高糖培养基(”“初出)、胎牛血清(澳洲胎牛血清，依科赛)、青-链霉素 双抗(HydOn力、MTT (IA阳%SeqUSA )。2.3 实验仪器二氧化碳细胞培养箱(IL-185VT, STIK,USA)、BIo-TEKELX800全自动酶 标仪(Thermo,Finland)、HH-6中数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、高速低 温离心机(CentrifUge 5804R, Eppendorf, Germany )o2.4 相关试剂配制(1)培养基：10%血清，1%双抗(青霉素、链霉素)，用DMEM高糖培养 基定容；(2)胰酶终止液：10%血清，用DMEM高糖培养基定

6、容；3实验方法3.1 实验基本操作3.1.1 细胞冻存细胞在培养瓶中培养至对数生长期，弃培养基后用2mL DPBS清洗，加入 2mL胰酶消化90s,继续加入4mL终止液（10%血清）终止消化，完全转移至 15mL离心管中（离心条件:室温25, 1000rpm, IOmin）,离心收集细胞。离 心后弃清液，加入L8mL冻存液（DMEM:血清：DMSO=5: 4： 1）吹打悬浮 细胞后转移至冻存管，程序降温湿盒-80降温24h,于-80C冻存。（或冻存管置 于4ClOmin后，转移至-20降温30min-2h,最后置于-80冻存；-20不宜放 置太久，易产生冰晶损伤细胞，30min-2h冻存液冻结

7、即可转移）。3.1.2 细胞复苏取冻存细胞于37水浴中快速解冻（适当速度持续晃动冻存管），解冻后悬 浮细胞并转移至安剖瓶中，加入5mL新鲜培养基（10%血清、1%抗生素）于培 养箱中进行培养（培养箱条件：37、5% CO2）o每天观察，清洗死细胞，更换 新鲜培养基，直至生长情况良好后传代。3.13 细胞传代培养瓶中的细胞弃培养基后用2mL PBS清洗，加入2mL胰酶消化90s,继 续加入4mL终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15mL离心管中（离心 条件：室温25C, IOOOrpm, IOmin）,离心收集细胞。离心后弃清液，加入2mL 培养基吹打悬浮细胞后分瓶培养，每瓶加入5mL新鲜

8、培养基于培养箱中进行培 养。3.14 4细胞药物处理弃培养基后用2mL PBS清洗，加入2mL胰酶消化90s,继续加入4mL终止 液（10%血清）终止消化，完全转移至15mL离心管中，吹打混匀细胞后取200 UL细胞悬液在血细胞计数板上进行计数（计算公式：细胞数/4*6*10人4）。离心 （离心条件：室温25C, 1000rpm, IOmin）收集细胞。离心后弃清液，根据接 种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中，补足培养 基，于培养箱中进行培养。表1细胞接种量细胞培养板接种量培养基（nL）6孔50万/孔224孔37.5万/孔196孔7万/孔0.2接种至细胞贴壁后更换含不

9、同浓度药物的培养基培养。3.2实验方法3.2.1 Hoechst 染色法3.2.1.1 实验原理凋亡细胞在形态上可见与周围细胞脱离接触，细胞变圆，细胞膜向内皱缩、 胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞 膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞 噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而 不引起炎症反应。未染色细胞的凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现 发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落现象。 染色后的凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡 小体

10、等典型的凋亡形态。正常活细胞对染料有拒染性，蓝色荧光较少；凋亡细胞有膜通透性改变，主 要摄取HoeChSt染料，表现为强蓝色荧光。所以HOeChSt染色可以观察凋亡。3.2.1.2 细胞 Hoechst 染色弃培养基后用2mL PBS清洗，加入2mL胰酶消化90s,继续加入4mL终止 液（10%血清）终止消化，完全转移至15mL离心管中，吹打混匀细胞后取200 UL细胞悬液在血细胞计数板上进行计数（计算公式：细胞数4*6*104）。离心 （离心条件：室温25C, IOOOrpm, IOmin）收集细胞。离心后弃清液，根据接 种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞。预先将细胞爬片放入24

11、孔板（尽量放置于中间位置），将混匀的200 UL细 胞悬液从载玻片中间加入（尽量不要让加入的细胞悬液扩散，保持液滴状），小 心移动培养板置于培养箱中进行培养。接种贴壁后更换含ImM I-rha药物的培养基培养48h处理后取出24孔培养 板，PBS清洗后加入IOOuL HoeChSt33324染液（购自碧云天），37避光染色 30min （此过程可置于培养箱中进行）。染色结束后，用PBS清洗3遍。用钩子和镜子小心取出载玻片，向盖玻片细胞生长面滴加25 UL抗荧光淬 灭封片液，小心贴合细胞生长面于载玻片（尽量不要产生气泡）。封片后在荧光 显微镜下观察，随机选取区域拍照，用紫外光激发。荧光显微镜下观

12、察并计数凋亡指数（apoptotic index： percentage of apoptotic cells）o每个样本随机观察4个视野进行计数。计数IOoO个细胞，凋亡指数=凋 亡细胞数/1000X 100%。凋亡指数取前后2次计数的平均值。实验重复3次。3.2.2 Tunnel 法3.2.2.1 实验原理末端脱氧核昔酸转移酶（TerminalDeoXynUCIeOtidyITranSferase, TdT）,是一 种不依赖模板的DNA聚合酶,可以催化脱氧核甘酸结合到断裂DNA分子的 3,-OH末端，且突出、凹陷或平滑末端的单链或双链DNA分子均可作为其底物。 细胞凋亡发生时，相关DNA内

13、切酶会被激活，从而切断核小体间的DNA。在细 胞凋亡晚期，DNA会被降解为18020ObP的片段，形成大量的3,-OH末端。TdT 介导的 dUTP 末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL）是 在TdT的催化下将荧光素标记的dUTP （fluorescein-dUTP）与断裂DNA暴露的 3：OH聚合，延伸后的DNA通过荧光显微镜进行检测。因此，凋亡细胞可通过 这种方法被荧光标记，而正常细胞荧光信号较弱。3.2.2.2 细胞Tunel染色细胞传代用24孔板培养，培养6-10小时至贴壁，换成含ImM异鼠李素的 培养基，再培养24hr,用全

14、式金TUNEL试剂盒进行测定。实验前的准备：（1）甲醛固定液（含3%甲醛、2%蔗糖的PBS）（2）细胞通透液（含 0.1%TritOnX-Ioo 的 PBS）3.2.2.3 DNaSel 和 10*DNase I Reaction Buffer （购自全式金）（4）抗淬灭封片剂（购自碧云天）操作步骤：（1）固定：24孔板中的贴壁细胞用PBS浸泡清洗1遍，使用甲醛固定液室 温固定30min （每孔200微升），随后用PBS润洗3次，每次5分钟。注意：每 测一组需要3个空白组（阳性、阴性和空白），一个实验组。（2）通透：加入足量细胞通透液（每孔200微升），确保完全浸没细胞，室 温静置5分钟。（3

15、）阳性对照处理：将上述处理后的一个空白孔作为阳性对照细胞。用细 胞通透液稀释10*DNase 1 Reaction Buffer （10微升）至1* （ 100微升），并加入 DNaSe I （终浓度10-15 UmL）,混匀后加至阳性对照样本，室温孵育30分钟。 用细胞通透液润洗阳性对照样本3次，每次5分钟。（4）将50微升l*Labeling Solution与2微升TdT混匀后（算好总体积， 混匀后再分开加）滴加至去除通透液的细胞表面，37水浴避光标记1小时。设 置不含TdT的阴性对照组（只加50微升IlabelingSolution,使用一个空白孔）。（5）细胞通透液润洗3次，每次5分

16、钟。（6）吸净液体，加入1-2滴抗淬灭封片剂封片，并尽快通过荧光倒置显微 镜观测荧光，用蓝光进行激发，观察有无绿色荧光。4实验结果与分析4.1 Hoechst染色结果Hoechst染色可以观察凋亡。正常活细胞对染料有拒染性，蓝色荧光较少;凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取HoeChSt染料，表现为强蓝色荧光。结果显 示，与对照组相比，ImM异鼠李素处理48h的细胞有部分细胞在紫光激发下表 现为强蓝色荧光，细胞核呈致密浓染，显示为发生明显的凋亡。相比之下，对照 组几乎没有（只有极少数）表现为强蓝色荧光的凋亡细胞。AB图1异鼠李素对黑色素瘤细胞影响的HOeChSt染色注：A和B图为24孔板细胞爬片后用荧光显微镜拍照结果，其