毛细管电泳基本理论.docx

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1、毛细管电泳基本理论电泳电泳(e1ectrophoresis)分离是基于组分在电场作用下迁移速度不同而进行的。一个离子在电场下的迁移速度为：V=式中y为离子移动速度，H为电泳淌度，E为电场强度。电场强度是指单位距离的电压降(Vcm),电泳淌度是指单位电场下离子的迁移速度；对于给定的离子、分离介质和操作温度，电泳淌度是一常数。电泳淌度正比于离子受到的电场力，反比于通过分离介质时的摩擦力，即：电场力(Fe)Mec摩擦力(尸F)而电场力户e：尸E=gE摩擦力4正比于离子的迁移速度，方向与电场力相反。对于球形离子：FF=fv=-6Ry式中q为离子电荷，/为摩擦系数，V为介质粘度，R为离子半径。当电场力与

2、摩擦力相对平衡时，离子以稳态速度运动。即：qE=6Rv显然，可以得到电泳淌度为=f6R上式表明，分子半径小、电荷大的离子具有较大的电泳淌度；而分子半径大电荷小的离子具有较小的电泳淌度。电泳淌度的差异，构成了电泳分离的基础。电渗电渗流的产生电渗(e1ectroosmosis)或电渗流(e1ectroosmoticf1ow,EOF)是指管内溶液在外力电场作用下整体朝一个方向运动的现象。对于石英毛细管来说，在一般情况下，由于硅醇基(一SiOH)电离成Sio,使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子(一般为阳离子)被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极移

3、动，由于离子是溶剂化的所以带动了毛细管中整体溶液向阴极移动，整个过程如下图所示。电渗的大小可用电渗速度或电渗淌度来表示：c,式中k为电渗速度，山。为电渗淌度，C为双电层的Zeta电位，为分离介质的介电常数。在毛细管电泳分离中.EoF引起缓冲液从毛细管的一端向另一端流动。在通常情况下,石英毛细管中的EoF流向阴极，EOF速度可用实验方法求算：KoZ/Ieo式中，为毛细管柱有效长度（从毛细管进样端至检测窗的长度），M为电渗流标记物（中性标记物如：二甲亚巩、丙酮等）从进样端迁移至检测窗所需时间。电渗流的特点在毛细管电泳中电渗流的一个重要特点是具平面流型，其电渗驱动力沿毛细管均匀分布，电渗速度的径向分

4、布几乎是均匀的。高效液相色谱液体流型则是抛物线状的层流，它在柱内壁上的速度为零，而中心速度为平均速度的2倍。电渗流的平流型速度曲线与高效液相中高压泵驱动所产生的层流或抛物线流型速度曲线不同，不会直接引起样品组分区带扩散。下图为毛细管电泳电渗流和高效液相液体流的比较,这是毛细管电泳获得高效分离的重要原因之一。电渗流的另一个特点是可以使几乎所有的样品组分不管电荷大小，以同样的方向移动,各组分在毛细管中的流出时间（迁移时间）取决于电渗流速度和组分电泳速度的矢量和。在一般情况下，电渗流方向从阳极到阴极，且电渗速度一般大干电泳速度，所以阴离子（除无机离子）也在阴极流出。因此。合理地利用电渗流可以使阳离子

5、、中性分子、阴离子实现同时分离分析。样品各组分电迁移过程如下图所示。电渗流的控制电渗流是毛细管电泳中的基本操作要素，为了优化分离，往往需要控制电渗流。在毛细管区带电泳或胶束电动毛细管色谱中，电渗流是电泳分离的主要驱动力,但如果电渗流太大,将导致溶质组分没有分离就流出。在毛细管电泳蛋白质分离中，带负电的毛细管壁通过静电相互作用造成带正电的蛋白质管壁吸附，消除毛细管壁的蛋白吸附一定程度上影响了电渗流的大小和方向.另外，毛细管电泳中一些分离模式，如：毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳和毛细管凝胶电泳均需要控制或降低电渗流。控制电渗流最基本的方法是改变毛细管内壁的表面电荷或缓冲液粘度。下表列举了改变电渗流

6、的常用方法。值得注意的是，改变毛细管壁表面的物理状态，常常影响被分离组分的迁移速度，因此，改变电渗流需要通过毛细管电泳整个操作条件的优化来实现。焦耳热和温度梯度在细内径毛细管中进行电泳分离与传统电泳比较，主要是减少了焦耳热的影响。焦耳热会引起电泳分离介质的温度梯度、粘度梯度和速度梯度，从而引起区带展宽。细内径毛细管允许高电场下电泳分离，但焦耳热的产生使高电场的进一步使用受到限制。焦耳热和温度梯度的产生焦耳热是由于电流通过电泳分离介质而产生，其大小取决于操作功率的大小，与毛细管尺寸，缓冲液电导及电场强度有关。通常毛细管电泳的操作电功率为0.55Wm,焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，在毛细管内

7、形成径向温度梯度一管壁温度低于管轴心温度。下表列出了不同内径毛细管的管壁温度及其与轴心的温差。显然，当毛细管电泳分离产生的焦耳热超过散发的热量，毛细管内温度将明显升高。毛细管壁温度和中心到壁的温差半径（m）壁温度（K）温差（K）25299.00.5350301.213975304.23.14100307.75.58125311.68.72焦耳热产生的温度梯度，一方面可能导致密度梯度，产生自然对流，而对流会使已分离样品区带重新混合，使柱效降低；另一方面会引起缓冲液的粘度发生变化，从而引起电泳淌度改变，导致区带展宽。一般，温度每变化介质粘度或电泳淌度变化2%3%。上表还表明，使用小内径毛细管比大内

8、径毛细管所产生的温差小得多，即使使用每厘米几百伏的高电场，小内径毛细管也能限制热量的产生（电流小），且高的表面积与体积比有利于说产生的热量从毛细管壁扩散。焦耳热和温度梯度的控制毛细管柱内过热的产生和可能存在的温度梯度具体表现在：分离效能随着操作电压的升高而降低；电渗流或溶质的迁移时间随着操作电压的增加而不成比例地增加；电流与电压不成线性关系（欧姆定律）等。温度梯度随操作功率的增加而增加，因此可以通过降低电压或通过降低离子强度或缓冲液浓度以减小缓冲液的导电性，使操作功率降低。尽管降低电场强度可以减少焦耳热，消除毛细管内的过热现象，但这不符合毛细管电泳发展的初衷。减少缓冲液浓度会降低缓冲容量及可能

9、导致溶质组分与毛细管管壁的相互作用增加，不利于毛细管电泳的优化分离。使用低淌度的具有大缓冲容量、低电荷的缓冲液（如：三羟甲基氨基甲烷、硼砂、组氨酸等）应该是降低焦耳热的一种有效方法。减小毛细管内径，温差显著降低，但细内径毛细管的使用会造成检测困难、样品进样少和毛细管易堵塞等问题。一般地，毛细管电泳分离多使用2575m内径的毛细管。从外部条件来看，采用毛细管温控系统实现毛细管外壁有效散热也是十分重要的。目前商品化毛细管电泳仪基本都配置高速流动空气或液体冷却系统控制毛细管温度。从理论上讲，液体冷却系统效果更理想，但对于电泳分离功率57Wm的操作条件，用高速空气进行毛细管温控也已足够了。温度控制不仅

10、对热扩散很重要，而且对保持毛细管恒温也是非常重要的。即使在没有焦耳热存在的情况下，由于室温的变化，导致分离介质粘度的变化（2%3%C）也会影响电泳分离定性定量分析的重现性，使溶质在毛细管内的迁移时间发生变化，样品进样量产生误差。迁移时间和有效淌度样品组分从进样口迁移到检测窗所需要的时间称为迁移时间（migrationtime,猛），它等于迁移距离除以迁移速度。在电渗流存在时，所测量的淌度称为表观淌度a.迁移时间和其他实验参数可用于计算溶质的表观淌度：I1mEmV式中山为表观淌度，/为毛细管有效长度，为迁移时间，1为毛细管总长度，E为电场强度，V为操作电压。毛细管有效长度是指从进样口到检测窗的长

11、度，对于柱上光学检测，有效长度要比总长度短520cm；对柱后检测器如质谱，有效长度等于总长度，计算迁移时间和淌度时使用有效长度，而计算电场强度时使用总长度。在毛细管电泳中，表现淌度实际上是电泳淌度和电渗淌度的矢量和：a=e+et,当溶质组分电泳方向与电渗方向相同时，网取正号；当组分的电泳方向与电渗方向相反时，eo取负号。电渗可用中性标记物来测定，如使用二甲亚巩、丙酮等测得其迁移时间，那么电修淌度：II1储Ete(N由表现淌度扣除电渗淌度，得荷电粒子的有效淌度(即电泳淌度)为：e=aeo以上面两式可以很方便地由毛细管电泳分离谱图计算出阳离子组分、中性溶质、阴离子组分的有效淌度。分离效能和分离度分

12、子扩散与理论塔板数电泳分离是以溶质的淌度差异为基础，而分离两个电泳区带所必需的淌度差异取决于区带的长度。在电泳分离过程中溶质由于在介质中的扩散而引起区带展宽。对于一个高斯峰,区带展宽对应的峰底宽度为：Wb=4式中航为高斯峰的峰底宽度，。为峰的标准偏差，可用时间、长度或体积表示。沿用色谱的理论塔板数来表示电泳分离效能，则N=(/O)OOOOOOOOA式中N为分离效能，/为毛细管有效长度。在理想的条件下(即小的柱塞式进样，无溶质与管壁的相互作用等等)，在毛细管电泳中，溶质区带展宽的唯一因素是纵向分子扩散。由于电渗流是平流型的，径向扩散对区带展宽的影响可以忽略，且毛细管的抗对流特性，对流引起的区带展

13、宽也不明显，因此，分离效能可以同色谱分离中的分子扩散项联系起来，即：a?=IDtm=(2D1)(V)B式中。为溶质的分子扩散系数，外为表现淌度，/为毛细管有效长度，1为毛细管总长度，V为操作电压。将式B代入式A,可得毛细管电泳分离效能的基本表达式：N=(/f1VZ)(2D1)当1时，上式可简化为：N=(/V)(2D)C上式为JorgenSon和1ukacs1981年提出的毛细管电泳分离效能经典公式。它表明，使用高电场强度可以获得高的分离效能，这是因为在高电场下溶质在毛细管内的迁移时间缩短，分子扩散减少。另外，生物大分子如蛋白质、DNA由于分子扩散系数小，区带展宽小，可以获得比小分子溶质高得多的

14、分离效能。实际的分离效能理论塔板数可以直接从电泳谱图中求得：N=5.54(tmW12)2oooooooD式中b为迁移时间，W/2为半峰宽。由式D求得的分离效能总是小于式C的理论计算，这主要是由于理论计算仅考虑分子扩散，而在实际电泳过程中还存在着其他因素的影响。分离度与色谱分离一样，用峰分离度可以表示电泳分离质量的好坏。分高度Kf定义为：K=2(tm2+tm)(W1+W2)式中猛为迁移时间，W为峰底宽度，脚标1,2分别代表两个组分。与色谱分离不同的是，毛细管由泳的分离主要是基于高的分离效能而不是选择性。由于电泳区带非常尖锐，即使在组分电泳淌度差别很小(V0Q5%=时，也可以使其完全分离。当然如果有足够的淌度差异，分离就十分容易了。毛细管电泳分离的分离度如果用分离效能来表示，则为：Rv=(N%4)(M4W)式中便=2/,jr1Jt=(2+)/2,小和2分别表示组分I和组分2的淌度。如果将式C代入上式，并用表观淌度外代替侬，那么：Rs=(1(42)()(V(D(/w)与分离效能关系式比较，分离度并非随着操作电压线性增加，而是与操作电压平方根成正比，但操作电压增加受到焦耳热的限制。从上式可知，当.和以“数值相等、方向相反时，可获得无限大的分高度，但此时分析时间接近无限长。因此，为了优化分离，应控制电泳操作条件，使其在尽可能短的分析时间内获得足够好的分高度。