蔗糖酶纯化电泳-生化实验五报告4.16.docx

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1、题目：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蔗糖酶纯度班级：食品质量与安全班日期：4月10日姓名：_雷灼贵_9号.小组成员：第11、13、15实验台号：_9号一教师评定一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳分离测定蔗糖酶纯度的操作方法。二、实验原理，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acry1amide,简称ACr）和交联剂N,N一甲叉双丙烯酰胺（Methy1ence-bisacry-1amide,简称Bis）在催化剂和加速剂的作用下聚合交联形成的具有分子筛效应的三维网状结构凝胶。凡以此凝胶为支持物的电泳均称为聚丙端酰胺凝胶电泳（Po1yacry1amidege1

2、e1ectrophoresis,简称PAGE）o凝胶筛孔大小、机械强度和透明度等物理参数，主要取决于凝胶浓度（T%）及交联度（C%）,随着这两个参数的改变，可获得对待测分子进行分离、分辨的最适孔径。丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。在连续系统中缓冲溶液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场的作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离；而在不连续系统中，不仅具有前两种效应，还具有浓缩效应，使电泳具有良好的清晰度和分辨率。电泳时样品的浓缩效应主要由以下原因产生：（1）凝胶孔径的不连续。在不连续的PAGE中,电泳凝胶由上下两层不同pH、不同孔径的浓缩胶和分离胶组成，在电场的

3、作用下，蛋白质颗粒在大孔的浓缩胶中泳动的速度快，当进入小孔分离胶时，其泳动过程受阻，因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孑1的这种不连续性造成样品位移受阻而压缩成很窄的区带。（2）缓冲体系离子成分及PH值的不连续性。在TriS-甘氨酸缓冲体系中，各胶层中均含有HCI,HCI在任何PH溶液体系中均容易离解出C1,它在电场中迁移率最大；甘氨酸等电点为6.0,在pH6.8的浓缩胶中，离解度很低，仅有01%1%的NH2CH2COO,因而在电场中的迁移速度很慢；大部分蛋白质p1在5.0左右，在此电泳环境中都以负离子形式存在。通电后，这三种负离子在浓缩胶中都向正极移动而且它们的泳动率按mdachmpapRiqa

4、q排序（有效迁移率等于迁移率m与离解度a的乘积）。于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被压缩成极窄的区带。（3）是由电位梯度的不连续性所至。电泳开始后，由于CI的迁移率最大，很快超过蛋白质，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的电导区，由此产生一个高的电位梯度，使蛋白质和慢甘氨酸离子在快离子后面加速移动，当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，由于蛋白质的有效迁移率正好介于快、慢离子之间而被浓缩形成一狭小的区带。当样品进入分离胶后，凝胶PH变为8.8,此时甘氨酸解离度大大增加，其有效迁移率也因此加大，并超过所有蛋白质分子。这样，快慢离子的界面（由浸酚蓝指示剂标记）总是跑在被分离的蛋白

5、质样品之前，不再存在不连续的高电势梯度区域。于是，蛋白质样品在一个均一的电势梯度和均一的PH条件下，通过凝胶的分子筛作用，根据各种蛋白质所带的净电荷不同，具有不同迁移率而达到分离目的。三、实验内容1样品上样及样品电泳11上样体积30微升。1.2 样品名称：自溶酶液、上样酶液、过柱收集酶液（21、2-2、2-3、2-4）、牛血清蛋白。1.3 上样完毕,正确连接电泳槽与电泳仪的正负极，选择28mA恒定电流，开始电泳。并记录初始电压。1.4 当漠酚蓝指示液离凝胶片的琼脂层1.5cm左右时电泳结束，关闭电源。记录终止电泳电压。15在老师的指导下，进行凝胶片与玻璃板的分离1.6 凝胶片染色与脱色（老师完

6、成）2.练习凝胶板的制备（利用电泳空余时间）2.1 电泳槽安装2.2 灌胶（配制8%凝胶浓度的分离胶和4%凝胶浓度的浓缩胶）2.3 灌胶2.3.1 分离胶制备：将配制好的分离胶，连续缓慢地沿长玻璃板板壁注入凝胶模，直至胶液的高度达到彳巍璃板板面2/3左右，用注射器小心流加入2cm左右高度的双蒸水覆盖胶面，其加水速度应控制在不破坏胶层分度。约60min左右后，当凝胶与水层间出现折射率不同的分层面时，表明凝胶聚合完成。倾去胶层蒸储水,再用双蒸水洗涤胶面，以除去未聚合胶液，并用滤纸吸干多余的水。2.3.2 浓缩胶置备：用微量的未加TEMED的浓缩胶洗涤分离胶面一次，倾去洗涤用的浓缩胶液，用滤纸吸干多

7、余的胶液。然后将配好的浓缩胶连续缓慢加到已聚合的分离胶的上方，直至距离短玻璃板上缘约Imm处为止，随后将样品槽梳子轻轻插入浓缩胶内。待凝胶聚合后，小心拔出槽梳板，注意不要弄断或弄裂胶层。用长针头轻而有序地将每个凹形样品槽修饰整理，加双蒸水清洗槽坑，最后用针筒抽干凹槽内的双蒸水。四、数据记录4样品电泳时电压变化时间（min）电压（V）时间（min）电压（V）018440294102084531615216503462022455372252386040830252654303527066434备注：2号-自溶醒液；3号一上样的液；4、10号一过柱收集酶液2-15、U号过柱收集酶液2-2；6、7号

8、-过柱收集酶液2-38号过柱收集酶液2-4、；9号一牛血清蛋白五、数据处理与分析5.1样品电泳时间与电压的关系结论：由样品电泳时间与电压的关系图可以看出恒流条I牛下进行电泳电泳仪的电压与样品电泳的时间符合一定的线性，即随着电泳时间的增长，电压线性增加。5.2.1 上柱酶液（3号）与自溶酶液蛋白质（2号）组分比较，有较好的纯化效果，蛋白带有减少，即表明部分杂蛋白去除。5.2.2 从葡聚糖凝胶柱层析收集的酶液样品与上柱酶液样品蛋白质组成比较中，过柱收集酶液2-1,（即洗脱峰一的前半段峰收集浓缩液，4号）分子量为较大的组分，蛋白质条带只有上柱酶液（3号）分子量大的条带，即其在图中条带的上部分。过柱收

9、集酶液2-2（即洗脱峰一的后半段峰收集浓缩液，5号）分子量为相对较小的部分，其蛋白质条带为上柱酶液（3号）蛋白质条带的中间部分。柱收集酶液2-3（即洗脱峰二收集浓缩液，6、7号）由于上样样品蛋白质浓度过低，导致蛋白质条纹不清晰，但仍可较模糊地看到在分子量小的部位,及凝胶中下方有模糊的条带，表明该样品的蛋白质相对分子质量集中于较小的部分，而且相对清晰的条带只有一条，更能表明此组分纯化程度很高。5.2.3 牛血清蛋白分子量为68kD,电泳图谱中牛血清蛋白（9号）出现三条蛋白质条带，可能原因是牛血清蛋白同时以单体（68kD）,二聚体（136kD）和三聚体（204kD）的形式存在。上柱酶液（3号）与自

10、溶酶液蛋白质（2号）各个组分的分子量均有分布。过柱收集酶液2-1蛋白质组分的分子量主要集中在160kD,且在分子量在160kD以下的蛋白质条带十分模糊，可认为基本上没有蛋白质条带分布。过柱收集酶液2-2蛋白质组分的分子量也主要集中在160kD,但在136kD以下有一条明显的蛋白质条带，而且比2-1少了两条分子量最大的蛋白质条带。过柱收集酶液2-3蛋白质条带主要集中在120kD,只有一条比较模糊的条带。电泳图造5.2.4 葡聚糖凝胶柱G-200对球型蛋白的有效分离范围为5X1O3-6X1O5,根据本次实验电泳图谱中上样酶液的相对分子质量分布，即主要集中在160kD,同时对于我们的目的蛋白质，根据

11、上次样品的酶活力测定结果，过柱收集酶液2-1酶比活力最低位37.23U/mg,2-2为53.14Umg,2-3为98.63U/mg,可初步估计我们的目的蛋白为过柱收集酶液2-3出现的蛋白质条带，分子量约为120kD凝胶柱层析纯化时应选用分辨率更高的葡聚糖凝胶柱G-150,其对球蛋白的有效分离范围为5X1O3-3X105或者分辨率更高的葡聚糖凝胶柱G-IOO,其对球蛋白的有效分离范围为5X1O3-1.5X1O5o这样经过层析柱纯化后，各组分蛋白质分离纯化效果将更好。六、总结与反思1 .对于电泳谱图,6、7号上样样品蛋白质含量过少，而2号上样样品蛋白质含量过多,导致这三个样跑出来的图谱都不清晰，应

12、根据各样品的蛋白质的含量，对其进行浓缩或者稀释，使蛋白质浓度达到3-5u1m1o2 .本次实验在练习凝胶板制备时，经历了两次失败。均由于操作的失误。第一次为未将电泳槽垂直板安装，将凝胶模放置于其中，让其保持垂直，并将其压紧。而我们是直接将凝胶模随便放置在桌面，未保持垂直,更未让凝胶模压紧，从而导致了灌胶时的大量漏液。第二次重做时，由于在时间的问题，为了加快浓缩胶凝固的时间，我们加多了一倍的TEMED,但是由于我们组员使用微量注射器进行添加TEMED时，未注意注射器里面有气体,导致原本加入80U1体积TEMED,变为只加了几UrrEMED,使凝胶的时间变得更加长。从中,我们更加深刻的明白，实验是

13、很容易失败的。只有更多的去了解、理解、熟悉实验，第一次成功的几率才会高，而想要做的更加好，只有不断地重复实验，而且每次重复前，好好对上一次实验进行总结。七、思考题一,根据实验过程,做好电泳实验的关键步骤有哪些？答：1凝胶制备好。第一，凝胶玻璃板须彻底清洗干净；第二，密封条（琼脂）要封好，不能漏水；第三，灌胶时不能有气泡产生，否则会影响后面凝胶的效果。2 .上样样品蛋白质浓度，不可过高或者过低，应控制在蛋白质浓度达到3-5u1m1c同时各上样体积加入量也许适宜，一般为上样孔体积三分之一为宜，而且要尽量保证各上样孔的体积一样，这样可使电泳图谱更加清晰。3 .根据实验的目的蛋白的相对分子质量，选择合适的分离胶和浓缩胶4 .上样样品尽量应在胶板中间的上样孔加样，两边边缘应加浸酚蓝染液，以此避免边缘效应。二、酶样品电泳染色图谱中出现多条谱带意味着什么？答：酶样品电泳染色图谱中出现多条谱带意味着上样样品中多个蛋白质组分，每一个条谱代表了一个组分。而且跑得最远的是分子量最小的蛋白质组分，而跑得最近的则是分子量最大的蛋白质组分。