异鼠李素对黑色素瘤细胞周期阻滞、黑色素含量与酪氨酸酶活性的影响研究.docx

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1、异鼠李素对黑色素瘤细胞周期阻滞、黑色素含量与酪氨酸酶活性的影响研究摘要：异鼠李素。机是一种丰富存在于鼠李属植物中的黄酮醇类黄酮化合物，具有抗肿瘤生物活性，细胞毒性较低，可应用于肿瘤防治。黑色素细胞瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，当前对黑色素瘤的治疗主要是通过调节酪氨酸酶活性的调节和表达水平，为了探讨异鼠李素抗小鼠黑色素瘤细胞的活性，本文以异鼠李素和小鼠B16黑素瘤细胞为试验对象，对B16细胞周期阻滞情况、黑色素含量和酪氨酸酶活性进行测定。结果表明，异鼠李素能明显抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖作用，并抑制酪氨酸酶活性，阻碍细胞黑色素的生物合成。为后期异鼠李素对黑色素瘤细胞的增殖调

2、控作用机制及细胞黑色素生物合成途径的调控作用机制研究提供了研究方向和理论基础。关键词：异鼠李素；黑色素瘤细胞；周期阻滞；黑色素含量；酪氨酸酶活性1前言黑色素细胞瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，恶性程度高，且尚无有效的治疗方法，治愈率低，是皮肤癌致死的主要肿瘤（75%）。以往的研究表明，恶性黑色素瘤与正常黑色素细胞相比，其酪氨酸酶表达会上调并产生明显的活性提高，说明黑色素细胞瘤的发病与酪氨酸酶的表达及活力具有直接关系。因此，对酪氨酸酶活性的调节和表达水平的调控是当前治疗黑色素瘤的重要方式。目前，已有报道的黑色素细胞瘤的防治手段主要有以下几种：（1）通过RT-PCR技术检测黑

3、色素瘤病人的外周血中酪氨酸酶的表达情况，鉴定血液循环系统中是否存在黑色素瘤细胞；（2）采用抑制剂对酪氨酸酶活性进行蛋白水平的调节，通过抑制酪氨酸酶活性预防和治疗黑色素细胞瘤；（3）建立原位治疗黑色素细胞瘤的前体药物合成模型，据此筛选对黑色素细胞瘤具有治疗作用的药物等。异鼠李素（图1）是一种黄酮醇类黄酮化合物，由棚皮素直接代谢产生，为淡黄色针状结晶,化学名为3,4,5,7四羟基一3一甲氧基黄酮,熔点为307,分子式CwH12。7,分子量316.26。异鼠李素在自然界广泛存在，尤其在银杏、沙棘等多种植物的花、果实和叶中含量丰富，具有广泛的生理和药理活性，不仅能抑制脂肪细胞分化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、

4、抗病毒等，而且对内皮保护、抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞、抗血栓及血小板凝集、抗氧化等多种心脑血管保护起重要作用。OH0XJ1zohO8H,图1异鼠李素的化学结构式近来，有研究表明，异鼠李素对酪氨酸酶的活性和细胞黑色素合成等具有明显的抑制作用，且其对酪氨酸酶活性的抑制作用具有现有酪氨酸酶抑制剂如氢醒、曲酸、壬二酸、熊果甘、维生素C等不具有的安全性高、抑制效果好、细胞毒性微小等优点，为黑色素细胞瘤防治药物的开发提供了新的思路。然而，目前就异鼠李素对肝癌细胞、鼻咽癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、结肠癌细胞等肿瘤细胞的抗性调控作用多有研究，其对黑色素瘤细胞的抗性效用研究尚未见报道。

5、因此，本论文就异鼠李素对黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响展开初步研究，旨在为后期异鼠李素对黑色素瘤细胞调控作用的深入研究提供理论基础。2实验材料和仪器2.1实验材料小鼠BI6黑色素瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。2.1 2主要试剂DMSO(Amreseo,USA)PBS(Hyc1one)0.25%胰蛋白酶消化液(HyCIOne)、DEME高糖培养基(HycIone).胎牛血清(澳洲胎牛血清，依科赛)、青链霉素双抗(HyCk)ne)、MTT(Amreseo,USA)2.3 实验仪器二氧化碳细胞培养箱(I1J85VT,STIK,USA)、BIO-TEKE1X800全自动酶标仪(Then

6、n0,FinIand)、HH-6中数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、高速低温离心机(CentrifUge5804R,Eppendorf,Germany)。2.4 其他用品卡式瓶、培养板（6孔、24孔、96孔）、离心管（1.5m1、15m1、50m1）、冻存管（5m1）、血细胞计数板、移液枪和枪头（5m1、Im1、IOOU1、IOU1）、试管架、锡箔纸、镒子、细菌滤器（0.22Um）、注射器（25m1）、盖玻片和载玻片、湿盒等。2.5 相关试剂配制（1）固定液：将4g多聚甲醛加入80m1PBS中，搅拌过夜或者搅拌过程中微热直至固体全部溶解，定容至IOOm1就成为4%的多聚甲醛固定液。（2） D

7、API染色液：在50Om1水中加入8.5gNaC1和1.2gTris碱，用盐酸调PH值至7.4,再加入4m1500mM的CaCh和44m1500mM的MgCh以及0.05g的BSA；最后加入IOmg的DAPI和Ioom1的DMSO,定容至11,4度保存。（3） 50mM磷酸盐缓冲液，pH6.9:分别配置50mMNaH2PO4和50mMNa2HPO4,二者混合值PH为6.9。（4） 1%多巴底物：0.1g1-DoPA用IOOm150mMPBS（pH6.9）溶解,避光分装冻存；（5）细胞蛋白提取裂解液：50mMPBS（pH6.9）,150mMNaC1,0.5%TritonX-100,5mMEDTA

8、,ImMPMSF（临用前加，IOOmM母液按1:100加入）；3实验方法与操作3.1 实验基本操作3.1.1 细胞冻存细胞在培养瓶中培养至对数生长期，弃培养基后用2m1DPBS清洗，加入2m1胰酶消化90s,继续加入4m1终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15m1离心管中（离心条件：室温25,IOOOrpm,IOmin）,离心收集细胞。离心后弃清液，加入1.8m1冻存液（DMEM:血清：DMS0=5:4：1）吹打悬浮细胞后转移至冻存管，程序降温湿盒-80C降温24h,于-80C冻存。（或冻存管置于4C1omin后，转移至-20降温30min-2h,最后置于-80冻存；-20不宜放置太久，

9、易产生冰晶损伤细胞，30min-2h冻存液冻结即可转移）。3.1.2 细胞复苏取冻存细胞于37水浴中快速解冻（适当速度持续晃动冻存管），解冻后悬浮细胞并转移至安剖瓶中，加入5m1新鲜培养基（10%血清、1%抗生素）于培养箱中进行培养（培养箱条件：37、5%CO2）o每天观察，清洗死细胞，更换新鲜培养基，直至生长情况良好后传代。3.1.3 细胞传代培养瓶中的细胞弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化90s,继续加入4m1终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15m1离心管中（离心条件：室温25C,IOOOrpm,IOmin）,离心收集细胞。离心后弃清液，加入2m1培养基吹打悬浮细胞后

10、分瓶培养，每瓶加入5m1新鲜培养基于培养箱中进行培养。3.1.4 细胞药物处理弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化90s,继续加入4m1终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15m1离心管中，吹打混匀细胞后取200U1细胞悬液在血细胞计数板上进行计数（计算公式：细胞数/4*6*10八4）。离心（离心条件：室温25C,IOOOrpm,IOmin）收集细胞。离心后弃清液，根据接种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中，补足培养基，于培养箱中进行培养。表1细胞接种量细胞培养板接种量培养基（m1）6孔50万/孔224孔37.5万/孔196孔7万/孔0.2接种至细胞贴壁

11、后更换含不同浓度药物的培养基培养。3.2实验方法3.2.1 周期阻滞3.2.1.1 实验操作按照上述方法培养黑色素瘤细胞，并进行ImM异鼠李素48hr处理，设置空白对照组。进行细胞DAP1染色，细胞DAP1染色实验步骤如下：(1)细胞用PBS漂洗一遍后，用4%多聚甲醛PBS室温下固定15min;(2)用PBS在室温下漂洗三次，每次IOmin；(3)用含有0.5%Trition-X-100的PBS在室温下穿孔15min；(4)用PBS在室温下漂洗2次，每次IOmin；(5)加入DAP1染色液室温下避光作用15min以上；用PBS在室温下漂洗2次，每次10分钟。然后用MD高内涵进行拍照分析，用DA

12、P1波段激发。用高内涵仪器拍照分析细胞周期。3.2.2 黑色素含量及酪氨酸酶活性3.2.2.1 实验操作(1)药物处理48h后取出24孔培养板，分别用Im1PBS清洗两次，吸净残留液体。(2)每孔加入细胞蛋白提取裂解液150微升，冰浴裂解30分钟(置摇床振摇)后收集到EP管中，4,1200OrPm离心5min。(3)取上清液测定蛋白含量和酪氨酸酶活性，沉淀进行黑色素含量测定。(4)蛋白含量测定采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒，操作方法详见说明书，测定样品液为离心上清液。(5)酪氨酸随活性测定方法：30微升酶液(离心上清液)+270微升1%多巴底物，37C保温0.5h,475nm下用酶标仪测

13、定吸光度。323异鼠李素对黑色素瘤细胞黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响黑色素发生形成的整个过程被称为“黑色素生物合成（me1anogenesis）。在哺乳动物中，黑色素形成的基本过程为：酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）催化酪氨酸使之羟化形成多巴；多巴进一步被酪氨酸酶氟化形成多巴醍；多巴醍经多聚化等反应形成假黑素，或者多巴酿生成多巴色素后，在酪氨酸酶、多巴色素异构酶等催化下将多巴色素聚合形成真黑素。在黑色素细胞和黑色素瘤细胞中，黑色素合成途径的酶包括酪氨酸陶、酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase-re1atedprotein1,TRP-D酪氨酸酶相关蛋白2（tyrosinase-re1

14、atedprotein2,TRP-2）0酪氨酸酶是黑色素生成的限速酶，作用于黑色素生成的起始阶段，催化酪氨酸使之羟化形成多巴，多巴进一步被酪氨酸酶氧化形成多巴醍。TRP-2,也称为13,4.多巴色素异构酶（DCT）,催化多巴色素异构为5,6-二羟基呷I噪2竣酸CTRP-I催化5,6二羟基口引味2竣酸形成较基引噪-5,6-醍。这三种酶被认为是黑色素生物合成最重要的调控因子。其中酪氨酸酶具有多重催化功能，在黑色素合成途径中起关键作用，它与诸如白化病和黑色素瘤等严重的皮肤疾病直接相关。因此，对酪氨酸酶活性的调节和表达水平的调控是影响黑色素生物合成途径和治疗黑色素瘤的重要方式。323.2黑色素含量及酪

15、氨酸酶活力测定待培养瓶中的细胞生长至对数期，弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化约90s,至细胞变圆后，继续加入4m1终止液（含10%血清的DMEM培养基）终止消化，完全转移至15m1离心管中（离心条件：室温25C,IOOOrpm,IOmin）,离心收集细胞。离心后弃上清液，用完全培养基调节细胞浓度约为3.75X1（）5jm1,每孔Im1细胞悬液接种于24孔板中，继续培养610小时，使细胞贴壁。弃去旧的培养基，加入含不同浓度异鼠李素的完全培养基Im1处理48h后取出24孔培养板，分别用Im1PBS清洗两次，吸净残留液体。每孔加入细胞蛋白提取裂解液150微升，冰浴裂解30分钟（置摇床

16、振摇）后收集到EP管中，4C,12000rpm离心5min取上清液测定蛋白含量和酪氨酸酶活性，沉淀进行黑色素含量测定。蛋白含量测定采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒，操作方法详见说明书，测定样品液的吸光度值（用细胞裂解液反应体系调0）。酪氨酸酶活性测定方法：30微升酶液（离心上清液）+270微升1%多巴底物，37保温0.5h,475nm下用酶标仪测定吸光度（用空白的底物调0）O黑色素含量测定方法：弃去上述细胞裂解液，向沉淀中加入400微升IMNaOH,80C保温Ih,离心（条件：412000rpm5min）,取上清，40Onm下测定吸光度（用NaoH溶液调0）。3.2.2.2黑色素含量测定方法加入400微升IM