2023冰冻人血清尿素和肌酐国家二级标准物质的研制.docx

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1、2023冰冻人血清尿素和肌酊国家二级标准物质的研制目的联合使用同位素稀释液相色谱串联质谱及酶学参考方法研制冰冻人血清尿素、肌酊国家二级标准物质，作为量值溯源的载体。方法参照JJF1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理和JJF1006-1994一级标准物质技术规范的要求对候选物质进行均匀性、稳定性、互换性评价；联合广东省中医院、北京航天总医院、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、迈克生物股份有限公司、北京利德曼生化股份有限公司、浙江美康生物科技股份有限公司的6家参考实验室采用国际检验医学溯源联合委员会推荐的同位素稀释液相色谱串联质谱法及酶学参考方法共同对标准物质进行定值，计算不确定度

2、。结果所研制标准物质均匀性的方差分析结果为P005,稳定性评价”直小于t(0.05)查表时的“直，互换性评价结果位于4个常规检测系统测量值95%置信区间内,最终定值结果为尿素:14.7mmo1/1,扩展不确定度0.3mmo1/1(k=2),肌酊：313.9mo11z扩展不确定度14.5mo11(Xr=2)。结论成功研制的冰冻人血清尿素、肌酊二级标准物质标示值可靠，均匀性、稳定性较好，不同检测系统间具有良好互换性。血清尿素、肌好检测是临床上最常用的肾功能检测项目,对衡量肾脏滤过功能、评估肾脏损伤程度具有重要价值E2,3o二级标准物质可用于校准、质量控制、相应试剂和方法的评估和验证、给其他样本赋值

3、等，对实现量值溯源具有重要作用。临床上，尿素、肌肝项目检测量庞大，厂家试剂盒种类繁多。无论是临床样本检测，还是厂家试剂盒校准都需要尿素、肌酊标准物质进行量值传递。因此，国内对相关标准物质的需求量很大，常存在供应短缺问题。目前，国内仅有国家卫生健康委临床检验中心研制的GBW(E)091000-091004o国外有美国国家标准及技术研究所研制的SRM909c二级标准物质，但其定值浓度尿素(4.320.09)mmo1/1、肌肝(72.891.61)mo11较低，不足以用来建立覆盖高浓度样本的标准曲线。从近年报道的结果来看,血清尿素、肌肝项目的正确度水平也还有待提高145,而使用新的标准物质有助于查找

4、相关原因。同位素稀释液相色谱串联质谱(isotopedi1ution1iquidchromatographytandemmassspectrometryzID-1C-MS/MS)方法比同位素稀释液相色谱质谱(isotopedi1ution1iquidchromatographymassspectrometry,ID-1C-MS)法以及传统的酶学、免疫学方法具有更优的特异性、选择性和可比性【6,7,是小分子定值的决定方法。为缓解国内尿素、肌酊标准物质供应不足，提高国内临床检验血清尿素、肌酊测量结果的正确度，实现测量结果的可溯源性和临床检验结果可比、互认。本实验室采用国际检验医学溯源联合委员会（J

5、oimCommitteeforTraceabi1ityin1aboratoryMedicine,JCT1M）推荐的ID-1C-MS/MS法研制了冰冻人血清尿素、肌酊二级标准物质。材料与方法一、材料液相色谱串联质谱系统由岛津UF1CXR色谱仪（日本岛津公司）和SCIEX5500QTRAP（美国SCIEX公司）质谱仪组成。临床检测系统：系统1:罗氏系统（cobas8000）生化分析仪、试剂（Iot:尿素0022475,肌酊0045801）、校准品（cfas,Iot:305596）和测量程序；系统2:贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪、试齐U（Iot:尿素6597,肌酊2457）、校准品（贝克

6、曼通用Iz1ot:F6662）和测量程序；系统3:罗氏（cobas8000）生化分析仪、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司试剂（Iot:尿素141319002,肌好121119017）、校准品（IOt:150118001）和测量程序；系统4:罗氏（cobas8000）生化分析仪、四川省迈克生物股份有限公司试剂（Iot:尿素1018091,肌好0319011）、校准品（Iot:366059）。同位素标记标准品：尿素-13C,15N2（美国Sigma公司，货号490954,批号MBBB6981V）,肌肝-D3（加拿大CDN公司，货号D-3689,批号M115P4）。一级参考物质：尿素（SRM-912

7、a）,肌酊（SRM-914a）购自美国国家标准及技术研究所。质谱级乙酸镀、甲酸均采购自美国Sigma试剂公司质谱级乙睛由美国FiSher试剂公司获得，去离子水由德国MerckMi11ipore纯水机制得。二、测量方法尿素和肌肝分别采用JCT1M参考测量服务列表中的参考方法NRMeth528和C7RMP269o质谱法中色谱条件为色谱柱：Accucore100AmideHI1ICCo1umn2.6m,100mm2.10mm(美国ThermoFisher公司)；流动相：A相为5mmo1/1乙酸镀水溶液，B相为乙睛；流速：0.3m1/min;进样体积：51;柱温:45;尿素洗脱方法：等度70%B,5m

8、in;肌酊洗脱方法：等度80%Bz5mino质谱条件：正离子模式；检测方式为多重反应监测(MRM),尿素、肌酊及其内标离子对检测参数见表1；其他主要参数：IOnSprayVo1tage(IS)本实验室设置为4.5,迈克实验室为5.0kv;CurtainGas(CUR)本实验室设置为20,迈克实验室为30;IonSourceGAS1(GS1)均为55;IonSourceGAS2(GS2)均为50;Co11isionGas(CAD)均为7;脱溶剂气温度均为尿素450,肌醉600oCe1尿素、财及其内标MRM检测离子对参数检用债质?(Da)子子(Da)停M时日(HH)tfe(V)f1fK(V)N附电

9、注(V)M16144300502312-1,15N246300502$12AW11444ISO402414VUF0311747150402414三、标准物质样本制备1.样本的选择与收集：选择外观清亮，无脂血、黄疸和溶血，距采血时间48h以内的新鲜样本。通过实验室信息系统筛查样本，将符合浓度或活性要求的样本记录在案，筛查感染性指标，收集乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋体、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒抗体检测阴性样本。将上层血清按组收集，避免吸入血细胞或分离胶等非血清成分。血清收集容器分为日收集管与总收集瓶，日收集管可采用洁净干燥容器，容量应满足当日收集量要求。总收集瓶为500m1聚碳酸酯瓶，每日

10、收集完毕后，将日收集管中血清注入总收集瓶中，再将总收集瓶置-70。（:保存。2 .样本的制备：每组样本达到预计收集量后，置室温融解，轻轻连续颠倒10次以上混匀，先用0.45m滤膜过滤,再用0.22m滤膜过滤,然后混匀器匀速搅拌混匀。3 .分装与储存：将样本分装至2m1螺旋盖塑料冻存管中，每管1.0m1,管外贴唯一性独立标识，置于冻存盒中-70。（:冰箱保存，每日监控冰箱温度。四、标准物质评价按照JJF1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理10和JJF1006-1994一级标准物质技术规范11要求进行均匀性、稳定性、互换性评价。均匀性和稳定性评价均在罗氏cobas8000全自动生化

11、分析仪上测量。互换性评价采用ID-1C-MS/MS参考方法与4种临床常用检测系统（详见材料部分）。1 .均匀性评价：按照随机数字表抽取15份样本，在一个批次内完成测量，每份样本重复测量3次。结果采用单因素方差分析。冰冻人血清尿素、肌好标准物质由于样本不均匀性引入的不确定度分量：由于方差分析结果中的组间方差MSamong大于组内方差MSwithin时,样本间均匀性的标准偏差Sbb及不均匀性导致的不确定度分量按下列公式计算：Sbb,re1=Ubb,re1=，(MSamQng-MSWithin)/n+X100%2 .稳定性评价：采用同步稳定性进行评估。结果采用回归分析的t检验，基本模型可按公式表示Y

12、=Bo+iX式中：i,o为回归系数；x为时间；Y为标准物质的特性值3 .短期稳定性评价：评价运输对标准物质待定特性值的影响。于第1、2、3日分别从-70冰箱中取出样本放置于干冰冷冻包装箱-65OC以下）,与第5日从-70C冰箱中取出的样本同时测量。每个水平1个监测点抽取2份样本，共4个监测点，8份样本。在1个批次内完成，每支样本重复测量3次，之后每年检测1次，用于考察长期稳定性。4 .长期稳定性评价：评价标准物质-70。（:保存1年的稳定性。于第0、7、31、90、182天分别从-70OC冰箱中取出样本,放置于液氮瓶中,与第365天从-70OC冰箱中取出的样本同时测量。每个水平1个监测点抽取3

13、份样本，共6个监测点，每个水平18份样本，每支样本重复测量3次。5 .使用时稳定性评价：评价标准物质使用时储存于冰箱（28）或室温（20-25）的稳定性。于第2、4、6、24h分别从-70。（:冰箱中取出4份样本，分别放置于冰箱或室温中各2份，与测量前从-70。水箱中取出的样本同时测量。每个水平1个监测点抽取4份样本分别放置于冰箱或室温中各2份进行稳定性检验，共5个监测点。在1个批次内完成，每份样本重复测量3次。6 .稳定性引入的不确定度：由稳定性引入的不确定度按照下列公式计算：us=S（SI）XX式中：US为由稳定性引入的不确定度；S（B1）为B1的标准偏差；X为给定的保存期限7 .互换性评

14、价：互换性采用最小二乘法进行线性回归分析。8 .参考检测系统依据JCT1M发布的尿氨NRMeth52）、肌酬C7RMP26）参考测量程序，建立ID-1C-MS/MS一级参考测量方法。9 .临床互换性评价检测系统：采用4种常用的临床检测系统（详见材料部分）进行互换性评价，各检测系统均基于酶法检测原理。采用临床上常用的4种检测系统（详情见材料部分）。10 .样本：共20份新鲜单供体的血清浓度范围覆盖标准物质浓度范围，每个样本重复测量2次。五、定值1.定值方法：JCT1M推荐的质谱法8,9和酶法12J3o标准物质每个项目每日制样3次进行测量，连续测量3d1每天单独建立标准曲线，共得9个测量结果。2

15、.定值方式：中国合格评定国家认可委员会认可的参考（校准）实验室联合定值。尿素定值单位：共6家实验室包括：（1）广东省中医院，（2）北京航天总医院，（3）深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，（4）四川省迈克生物股份有限公司，（5）北京利德曼生化股份有限公司，（6）浙江美康生物科技股份有限公司。肌好定值单位：共4家实验室包括：（1）广东省中医院，（2）上海市临床检验中心，（3）四川省迈克生物股份有限公司，（4）浙江美康生物科技股份有限公司。3 .质量控制：各实验室测量有证参考物质SRM909cz结果在不确定度范围内；或测量国际参考实验室能力验证样本RE1A,结果在等效限内。4 .定值及其引入的不确定度计算：根据测定数据服从正态分布状态，组间数据是否为等精度进行计算。5 .结果检验：使用Shapiro-Wi1k进行正态分布检验，采用格拉布斯（Grubbs）进行组内可疑值检验和各组数据平均值显著性检验，组间数据等精度检验采用科克伦（Cochran）法。6 .标准值的不确定度评定：标准物质的合成标准不确定度（UCRM）计算：uCRM=ubb+uks+usts+har式中：Ubb为由瓶间不均匀性引入的标准不确定度；U1ts为由长期不稳定性（1年）引入的标准不确定度；UStS为由短期不稳定性引入的标准不确定度；UChar为由定值引入的标准不确定度扩