初始人类 B 细胞参与 SARS-CoV-2、相关变异体和相关 sarbecovirus 的受体结合域.docx

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1、初始人类B细胞参与SARS-CoV-2相关变异体和相关sarbecovirus的受体结合域已有的针对SARS-CoV-2的免疫力感染或接种疫苗后保护性体液免疫反应的发展取决于幼稚B细胞的募集、激活和成熟。未感染个体中SARS-CoV-2的幼稚B细胞库的特异性尚不清楚。费尔德曼等人.对来自血清阴性供体的SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的幼稚B细胞进行B细胞受体（BCR）测序。在所有供体中鉴定出RBD特异性幼稚B细胞，从这些BCR序列产生的重组抗体与SARS-CoV-2的RBD和相关变体具有亲和力。此外，这些幼稚和亲和力成熟的抗体能够中和SARS-CoV-2o这些发现表明，RBD特异性幼稚

2、B细胞前体存在于整个人群中，这可能为未来的疫苗设计提供信息。抽象的最初接触病原体会引发适应性免疫反应，以控制和消除威胁。探究幼稚B细胞库的丰富性和特异性有助于了解如何进行保护性反应。在这里，我们从8个针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合域（RBD）的血清阴性人类供体中分离出幼稚B细胞。单细胞B细胞受体（BCR）测序确定了不同的基因用途，并且对互补决定区长度没有限制。由与SARS-CoV-2RBD结合并参与循环变体（包括B.1.1.7、B.1.351和B.1.617.2）以及萌芽前蝙蝠衍生冠状病毒RaTG13的幼稚B细胞前体产生的重组抗体子集、SHC104和WIVE通

3、过对与SARS-CoV-2刺突复合物复合的初始抗体的结构表征，我们确定了一种与感染诱导的抗体共享的保守识别模式。我们发现代表性的幼稚抗体可以在B细胞活化测定中发出信号，并且通过使用定向进化，我们可以选择由单个氨基酸变化赋予的更高亲和力的RBD相互作用。最小突变、亲和力成熟的抗体也有效地中和了SARS-CoV-2o了解SARS-CoV-2RBD特异性的幼稚库可能会为能够识别未来SARS-CoV-2变体或新兴冠状病毒的潜在反应提供信息，从而能够开发旨在参与保护性种系反应的泛冠状病毒疫苗。我们发现代表性的幼稚抗体可以在B细胞活化测定中发出信号，并且通过使用定向进化，我们可以选择由单个氨基酸变化赋予的

4、更高亲和力的RBD相互作用。最小突变、亲和力成熟的抗体也有效地中和了SARS-CoV-2o了解SARS-CoV-2RBD特异性的幼稚库可能会为能够识别未来SARS-CoV-2变体或新兴冠状病毒的潜在反应提供信息，从而能够开发旨在参与保护性种系反应的泛冠状病毒疫苗。我们发现代表性的幼稚抗体可以在B细胞活化测定中发出信号，并且通过使用定向进化，我们可以选择由单个氨基酸变化赋予的更高亲和力的RBD相互作用。最小突变、亲和力成熟的抗体也有效地中和了SARS-CoV-2o了解SARS-CoV-2RBD特异性的幼稚库可能会为能够识别未来SARS-CoV-2变体或新兴冠状病毒的潜在反应提供信息，从而能够开发

5、旨在参与保护性种系反应的泛冠状病毒疫苗。亲和力成熟的抗体也能有效中和SARS-CoV-2o了解SARS-CoV-2RBD特异性的幼稚库可能会为能够识别未来SARS-CoV-2变体或新兴冠状病毒的潜在反应提供信息，从而能够开发旨在参与保护性种系反应的泛冠状病毒疫苗。亲和力成熟的抗体也能有效中和SARS-CoV-2o了解SARS-CoV-2RBD特异性的幼稚库可能会为能够识别未来SARS-CoV-2变体或新兴冠状病毒的潜在反应提供信息，从而能够开发旨在参与保护性种系反应的泛冠状病毒疫苗。介绍通过自然感染或疫苗接种最初暴露于病毒抗原会引发免疫反应，并且通常会建立免疫记忆，从而预防或控制未来的感染。原

6、始库包含能够识别这些抗原的潜在B细胞受体（BCR）重排，这些抗原通常是表面暴露的糖蛋白。产生体液免疫的早期步骤包括通过识别同源抗原（1）激活这些幼稚B细胞，这反过来又可以通过体细胞超突变（SHM）和随后的分化导致亲和力成熟（N）。幼稚曲目的最初参与开始了这种级联反应，并且通常与最终产生保护性或中和抗体反应（3）相吻合。对于严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）,即2019年冠状病毒病（COVID-19）的病原体，在初次感染或接种疫苗后产生中和抗体反应与防止非人类灵长类动物再次感染有关。9）。在人类中，中和抗体的存在可以预测原发性SARS-CoV-2感染（）或接种疫苗（/）后的

7、疾病严重程度和存活率。此外，体液免疫记忆的两个分支，长寿骨髓浆细胞（8）和循环记忆B细胞（9,10由人类自然感染引起，在初次感染后可能持续至少8个月，提供潜在的持久长期保护。恢复期的C0VID-19个体和疫苗接种者中存在相当水平的中和抗体滴度（1）,这进一步支持了适应性免疫反应在帮助控制和预防疾病严重程度方面的作用。感染和疫苗引发的抗体都主要针对存在于病毒粒子表面的主要SARS-CoV-2包膜糖蛋白尖峰。中和反应的一个重要组成部分涉及受体结合结构域（RBD）,并通过直接阻断与病毒进入的宿主受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的相互作用来实现这一点（”）。分离的RBD导向单克隆抗体来源于不同的重链

8、和轻链可变基因片段，这表明用于开发RBD导向抗体的多种生化解决方案是在人类B细胞库中编码的（，1）o该抗原位点的潜在免疫原性基于人类幼稚B细胞库和幼稚BCR的总体频率，这些幼稚BCR具有一定水平的内在亲和力以刺激其激发(25-77)o然而，幼稚B细胞的抗原特异性在很大程度上是不确定的。研究抗原特异性幼稚B细胞的传统方法包括对可用BCR数据集的生物信息学挖掘和通过“种系恢复”成熟BCR序列推断可能的种系前体。这可能分别受到重链和轻链配对序列数据的可用性和不可靠的互补决定区3(CDR3)环近似的限制。在这里，我们通过直接从血清阴性供体的外周血中表征对SARS-CoV-2RBD特异的人类幼稚B细胞来

9、解决这一限制，以了解它们的相对丰度、内在亲和力和激活潜力。止匕外，我们询问了SARS-CoV-2特有的幼稚库是否也可以涉及相关的循环变体和流行前的CoVo我们发现SARS-CoV-2RBD特异性幼稚B细胞的基因使用不受限制，并且几个分离的B细胞对循环的SARS-CoV-2变体和相关的CoVRBD具有亲和力。我们确定了一种具有代表性的初始抗体的结构，该抗体结合SARS-CoV-2RBD,其识别模式类似于人类对SARS-CoV-2感染的反应中普遍存在的多供体抗体类别。止匕外，我们提高了两种代表性幼稚抗体对RBD的亲和力，并表明起始幼稚特异性决定了进化克隆到循环变体的广度。对SARS-CoV-2RB

10、D的人类幼稚抗原特异性B细胞库的分析及其识别相关变体和新兴CoV的能力可能会为下一代疫苗的表位聚焦免疫原的合理设计提供信息。结果分离的SARS-CoV-2特异性幼稚B细胞具有遗传多样性为了测量对SARS-CoV-2RBD特异的幼稚人类B细胞的反应性，我们采用了一种体外B细胞分析方法，该方法以前用于研究靶向HIV-1（18）和流感病毒上的中和位点的表位特异性幼稚前体表面糖蛋白（丝）。我们设计了一种SARS-CoV-2RBD构建体，将两个聚糖定位在残基475和501处，以选择性地阻断与ACE2和受体结合基序（RBM）导向的抗体B38的结合（图SI）（Mo使用这种“ARBM”探针,除了野生型SARS

11、-CoV-2刺突和RBD探针，我们分离出幼稚的CD19+/免疫球蛋白D+（IgD+）/IgG-对RBD特异的B细胞，更准确地说，是来自8名SARS-CoV-2血清阴性人类供体外周血的RBM（图1A和图SIE）o我们将RBM特异性定义为与荧光标记的尖峰和RBD结合的B细胞，但不与ARBM探针结合（图S2A）。虽然很少见，但所有八名供体都有可检测到的RBM特异性幼稚B细胞群（图S2B）。总B细胞和幼稚B细胞中RBM特异性B细胞的中位频率分别为0.0025和0.0029%（图1B）。在尖峰反应的幼稚细胞中，RBM特异性B细胞的中位频率为3.6%（图1C）o这表明幼稚反应所针对的大部分刺突表位位于RB

12、D之外。尽管使用了不同的流式细胞仪探针，但最近的研究表明，在接触抗原后，恢复期和接种疫苗的个体中RBD特异性B细胞的频率可能会增加约10倍（11）o此外，大多数IgD+RBM特异性B细胞是CD27（平均频率97%）,与幼稚B细胞表型一致（图S2C）o图。loSARS-COV-2特异性幼稚B细胞分离和表征。（A）来自血清阴性人类供体的RBM特异性幼稚B细胞通过CD19+IgD+IgG-门控的FACS分离；显示了来自捐助者6的代表性图。ARBM是一种分选探针，在残基501和475处具有N连接聚糖。RBM特异性B细胞在（B）总、幼稚和（C）来自每个供体（=7）的尖峰阳性细胞中的频率。红色条表示平均百

13、分比值。（D）热图显示所有配对B细胞序列的可变基因使用情况。比例表示每个供体（D1至UD5）的总序列百分比。（E）使用IMGT编号确定重（H）和轻（L）CDR3氨基酸（aa）长度分布。红色条表示中位氨基酸长度。（F）与推断的种系基因序列的分歧。红色条表示平均百分比值。身份证，身份。Spike(APC)(山d)dsARBM-Fc(BV786)+WCOB%Og9g)oLLQga0.005-0.004-0.003-0.002-0.001-0.0005-ooo o或二o4-3-2-1-。0JiSpike30-123 4 5DDDDD7WH9/QS.SX0-二H9一KrgHgNCAHO/8、19/导 一

14、一黑工9-1 9/OXH0_3.SX0-88工。86*8工。一9rLH9一6PWH9/8 二 H9一0COSH9一69d 9/6.8、工 9/- 一o o o2 1(强 6仁一 2Q0CL%TotalTHTL为了更详细地了解这个原始库的特性，我们从八个供体中的五个获得了163对重链和轻链抗体序列。序列分析表明，所有克隆都是独特的，具有不同的重链和轻链基因使用，以及最小的基因配对偏好（图ID）o这些数据反映了在从C0VIDT9恢复期个体（13,14）和疫苗接受者（11）测序的RBD特异性记忆B细胞中观察到的多克隆基因使用情况，表明抗原暴露后可以激活多种抗体前体库。通过将这种幼稚的曲目与来自非SA

15、RS-CoV-2特异性曲目的基因使用分布进行比较（幽，我们观察到IGHV3-9在五个测序供体中的四个中的平均曲目频率增加了约20%（图S3A）o这种IGHV3-9的富集也在来自恢复期个体（21）和疫苗接受者（11）的分离记忆B细胞中，以及在急性感染期间从一组C0VID-19个体测序的扩增IgG-细胞中观察到（肆）。这些扩增的克隆在症状发作后不久检测到，显示出低水平的SHM,表明1GHV3-9在早期滤泡外反应中的潜在使用，其中幼稚B细胞分化为短寿命浆细胞（23）o此外，1GHV3-53和IGHV3-30基因片段在从恢复期个体中分离的RBD特异性抗体（24）中过度表达，从三个已测序的供体（总共13个克隆；约占总数的8.0%）中回