2023诱导多能干细胞源性胰岛类器官的研究及临床试验进展.docx

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1、2023诱导多能干细胞源性胰岛类器官的研究及临床试验进展摘要胰岛细胞移植(ICT)受到供体来源和免疫抑制的限制，未广泛应用于临床。诱导多能干细胞(iPSC)作为胰岛细胞替代来源有望解决ICT供源短缺和免疫抑制的问题，已经开展的临床试验证实了胰岛素分泌细胞(IPC)植入后的安全性和有效性。该文重点论述iPSC来源的胰岛类器官涉及的有关问题和未来需要解决的困难，并提出最优化的诱导方案，旨在为iPSC诱导提供参考。此外，该文还阐述iPSC诱导的IPC在1型糖尿病治疗中的临床试验现状。目前1型糖尿病(type1diabetesme11itus,T1DM)治疗主要是通过外部输送胰岛素来维持稳定的血糖水平

2、，但依赖外部的输送将永远是一种治疗，而不是治愈。另外，胰岛移植供体稀缺、免疫排斥反应和高昂成本等因素”艮制了其临床应用1,这促使人们寻求新的替代疗法。Hwang等2已经成功诱导出诱导多能干细胞(inducedp1uripotentstemce11,iPSC)源性的胰岛样簇、聚集体以及胰岛类器官。胰岛类器官是在体外生长的原代细胞或iPSC,与体内胰岛具有相似的结构和功能，是T1DM治疗的新策略。已证实胚胎干细胞和iPSC诱导分化的胰岛素分泌细胞(insu1in-producingce11xIPC)都共同表达胰十二指肠同源框因子1(pancreaticandduodena1homeoboxfact

3、or1,PDX1)、NK6转录因子相关1(NK6transcriptionfactorre1ated1ocus1,NKX6.1C肽，并对葡萄糖刺激有反应3o总之，如何进一步优化iPSC诱导方案,更好地实现临床前研究向临床应用迈进是目前研究的重点。本文讨论了iPSC作为胰岛细胞替代来源的潜力和挑战,分析iPSC的来源和移植部位等不同方案的可行性，以及IPC在植入后面临的各种问题和解决方法。通过回顾iPSC不同的诱导方案并提出优化，最后阐述了目前IPC在临床试验中的进展，评估其安全性、有效性和局限性，并对未来进行展望。一、iPSC的前景和未来的挑战从iPSC诱导的IPe作为胰岛细胞的替代来源，一定

4、程度上解决了胰岛移植供源短缺的问题。目前能诱导为IPe的多能干细胞有胚胎干细胞、iPSC和成人干细胞，由于iPSC无伦理限制且易被免疫系统识别为自我，有效减少了免疫排斥的发生4o虽然iPSC可作为胰岛细胞的替代来源，但也面临诸多挑战，如IPC的干细胞来源和最佳移植部位、IPC植入后的问题和解决方法等2o另外，建立标准化的良好操作规范(goodmanufacturingpractices,GMP)对实现规模化、区域化生产胰岛B细胞也至关重要5o(-)iPSC的来源iPSC来源于自体、同种异体和异种异体。自体来源的iPSC是通过分离、提取自体iPSC,移植到体内以改善胰腺内分泌功能的一种途径。目前

5、已有研究证实慢性胰腺炎患者在胰腺切除术后可通过自体胰岛细胞移植(is1etce11transp1antationzICT)来摆脱胰岛素依赖6o同种异体来源是从人类单个优化iPSC中生成的大量胰岛样细胞。Roep7通过生产人类白细胞抗原特异性iPSC为胰岛类器官移植提供最佳血糖控制和较少偏离靶点生长的胰岛细胞源。目前异种异体来源的iPSC仍具有前瞻性，Anazawa等8发现猪来源的iPSC提供了一个潜在的胰岛细胞来源，但需更大规模的研究来评估其临床益处。综上，自体、同种异体和异种异体iPSC均可作为胰岛细胞替代来源。(二)移植部位目前研究的移植部位包括肾包膜下、皮下、网膜和门静脉。ICT的理想移

6、植部位首先要能释放生理性激素，还需具备移植部位的血管、环境支持和免疫保护能力等9oStice等10在小鼠模型中进行肾包膜下ICTz结果表明移植效果良好,没有异物排斥反应。Stae1s等11发现皮下和肌肉内移植有诸多优势，不仅容易移植，且可使用无创成像监测植入细胞的存活情况。Moore等12通过微创腹腔镜方法证明了自体网膜ICT的可行性,不仅减少了手术时间和成本,还减少了炎症反应的发生。另外，门静脉内ICT作为目前移植的重点部位，具备足够的激素释放到门静脉循环、足够的胰岛细胞植入以及可使用放射影像引导注射等优势；对于移植后门静脉血栓形成和出血风险增大的问题，可通过肝导管消融和使用肝素来解决13o

7、综上，门静脉内移植是最理想的移植部位，肾包膜下、皮下、大网膜部位的移植仍需更多研究评估其安全性和有效性。()IPC植入后的问题和解决方法1 .免疫抑制：免疫抑制是IPC植入后面临的问题之一。自体iPSC移植提供了一种解决方案，但成本较高，且移植后仍需要一定程度的免疫抑制。其他消除免疫抑制的方法包括iPSC基因编程和免疫调节14,基因编程是消除免疫抑制可行的方法之一，它不仅保护植入的IPC免遭免疫攻击，而且能有效控制炎症反应。GMP协议是一项干细胞衍生IPC的标准化操作规范，通过GMP协议产生的针对受体同种抗原的调节性T细胞,可实现最佳植入效果和减少免疫排斥的目的。Pepper等15通过上调人类

8、白细胞抗原抑制iPSC的T细胞活性研发出无免疫抑制的iPSC源性胰岛类器官，但仍需进一步的动物和人体实验。Shapiro等16研究发现药物可以改善植入后IPC的活力和功能，还有一些减少炎症反应和细胞凋亡的特异性药物可提高ICT的成功率，如白细胞介素1拮抗剂阿纳金拉和肿瘤坏死因子凶卬制剂依那西普等。2 .胰岛细胞功能不成熟：成熟的佟田胞可动态感知血液中葡萄糖水平的变化并自主调节体内的胰岛素分泌。Hogrebe等17证实了成熟细胞的标志物表达胰岛素(insu1in,INS)、葡萄糖-6-磷酸催化亚基2(g1ucose-6-phosphatecata1yticsubunit2,G6PC2肌腱膜纤维肉

9、瘤基因同系物A(muscu1oaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomo1ogueA,MafA运动神经元和胰腺同源盒-1(motorneuronandpancreashomeobox-1,MNX1)等。VerhOeff等18认为通过将早期的内胚层或胰腺祖细胞定向分化、移植后快速重建血运以及维持内皮细胞衍生信号的方法均有利于细胞功能成熟。另外，移植部位低血管化是导致植入后细胞丢失和不成熟的重要原因，可以通过集中递送血管内皮生长因子促进植入后的血运重建和内皮细胞迁移、增殖和存活促进细胞功能成熟1513 .肿瘤形成风险：肿瘤形成是IPC植入后面临的问题之一。目前已经研究出

10、几种降低致瘤风险的方法。首先，通过移植已分化的IPC或使用内分泌细胞聚类和靶向特异性信号技术都可有效预防肿瘤形成口9其次，研究发现使用化学抑制剂、免疫靶向或引入自杀基因(如单纯疱疹病毒胸苜激酶和硝基还原酶)的方法能消除或分选未分化的IPC,从而降低肿瘤形成的风险19o最后,使用小分子二聚化化学诱导剂可有效诱导大于99%的未分化干细胞凋亡来减少肿瘤发生率20o以上方法均具有创新性和前景，但尚不能完全保证其临床应用的安全性。二、iPSC不同的诱导分化方案目前iPSC诱导IPC产生的方法主要有以下3种：(1)利用生长因子或细胞因子；(2)利用微小核糖核酸(microRNA,miRNA);(3)使用三

11、维(3-dimension,3D)技术21o(-)利用生长因子或细胞因子诱导分化该方法是通过使用不同的生长因子和细胞因子诱导iPSC产生表达NKX6.1和PDX1的IPuOkita等22ISa引入OCt3/4、SOX2、K1F4和C-Myc转录因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞产生IPCoRajaei等23使用一种5阶段方案模拟体内胰腺器官发育，这种高效诱导方案可以产生约80%的IPCoZhu等24通过4阶段方案把恒河猴来源的iPSC依次诱导分化成定形内胚层、胰腺祖细胞、内分泌前体和IPC,最终获得表达PDX1+胰腺祖细胞的效率超过85%,并成功使50%的T1DM小鼠恢复正常血糖。综上，iPSC高效诱

12、导IPC的方案之一是通过调节胚胎发育的信号通路和转录因子，再现胰腺细胞分化的过程。（二）利用miRNA诱导分化目前高效生成iPSC的方法包括使用miRNA、具有遗传毒性且能减少靶细胞重编程的iPSC、非整合腺病毒、仙台病毒载体、纯化蛋白质、转座子和修饰核糖核酸等250其中miRNA可以直接抑制其靶基因来调节iPSC和决定胰腺细胞分化,使用miRNA诱导分化的速度和成功率很高，对重编程因子的化学计量和时间有灵活的控制。1i等26使用携带miR-181c-5p的慢病毒载体诱导iPSC分化的过程中发现，内胚层标志物及胰腺内分泌特异性基因的表达明显增加，使用该病毒载体可促进胰腺祖细胞和IPC的分化。综

13、上，miRNA为细胞重编程和诱导iPSC提供了一种高效的策略。（三）使用3D技术等优化方案诱导iPSC1.3D打印为iPSC诱导提供新策略：近年来，3D生物打印技术已经成功运用细胞外基质和血管重建胰岛内环境,并使用活细胞进行生物打印27o但若想要获得具有生理功能的仿生器官，还需优化两方面：一是选择合适的生物打印方法，目前主要有4种生物打印方法：微挤压、喷墨、激光和立体光刻，最常用的方法是微挤压和立体光刻；二是需要评估生物墨水中的细胞浓度和适当的生物打印条件,如压力、打印速度或交联方法等28JoDuin等29利用胰岛、细胞外基质生物墨水和内皮细胞，用3D生物打印了一个具有完整血管的仿生胰腺，拥有

14、60万个胰岛等量物，其功能已通过胰岛素分泌试验得到证实。总的来说，3D打印技术为T1DM替代疗法和胰腺组织工程提供了一种新方法。2.3D生物材料诱导iPSC:培养胰岛类器官的生物材料包括基质凝胶、层黏连蛋白、纤维连接蛋白和脱细胞支架等，均已被用于研究27oJensen和Teng30建立了一个由聚合物葡聚糖和明胶组成的3D支架，并成功把脂肪干细胞诱导分化为胰岛样簇。AbaZari制31通过实验对比iPSC和间充质干细胞在3D生物材料支架中诱导为IPC的效率,结果证实iPSC在3D支架中诱导的效率更高。Zarekha1i1i等32制造了含聚己内酯的3D纳米纤维支架，研究表明在这种支架中诱导的IPC

15、活力和胰腺特异性基因的表达显著提高。综上，3D生物材料支架在细胞培养中可以控制以及模拟体内细胞环境，有利于生成和记录细胞间相互作用、代谢分析等准确的数据。3.结合化学诱导和基因编辑诱导iPSC:在至今为止能够有效诱导产生IPC的方案中，化学分子诱导和基因编辑相互配合的方法主要通过优化调节信号通路和重建胰岛的空间结构起作用，能实现高效诱导IPC33o这种化学重编程方案通过将体细胞单独暴露于化学分子中，用外在的化学刺激来诱导iPSCz在分化的第5阶段，使用NEUR0D1诱导剂和信号通路抑制剂的小分子组合促进了胰腺内分泌祖细胞的分化，生产出相对均匀的胰岛聚合体,其中生成表达NKX6.1、C肽的IPC

16、效率约高达70%340三、IPC的临床试验进展目前已经开展了多项关于诱导生成IPC的临床前研究，但临床试验对于评估IPC的安全性和有效性也至关重要。(-)IPC产品临床试验进展目前已有7项使用干细胞来源的IPC用于T1DM治疗的临床试验注册35都是由ViaCyte公司发起的。2014年第1个试验NCT02239354采用2个队列评估不同剂量VC-O1TM联合产品在T1DM患者中的安全性、耐受性和有效性，Ve-O1TM产品包括人类胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞(pancreaticprecursorce11s,PEC)和封装装置。2016年,第2个试验目的是观察之前植入VC-OITM联合产品的受试者在研究期间设备的安全性、耐受性和C肽的产生能力。随着该试验完成，19名受试者的试验结果被公布：植入物耐受性良好，发