国家自然基金申请书写作：（2014年版本）实验方案范例.docx

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1、实验方案范例备注：红色字体部分请根据实验实际条件修改。一、基因操作1、基因A(GeneA)的敲减载体构建版本1：针对GeneA,在Sigma网站上搜索已验证过敲减效率的ShRNA序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链DNAo1igo,成为含干扰序列的具对应粘性末端的ShRNA表达框架。以Ecor1和BQmH1内切酶酶切PGP载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。将ShRNA表达框架插入pGP,转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序，构建含有针对GeneA的ShRNA骨架质粒。版本2:从Genebank调取人GeneA核菩酸序列，利用Ambion数据库软件设计针对GeneA的有效的

2、ShRNA序列，经B1QSt比对进行同源性分析后，选出特异性较高的3组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。取pGPShRNA载体15J1于EP管，用BQmH1I.51EcoRII1.51xIOxbuffer51酶切反应4h以上；产物回收加入T4DNA1igose使GeneAShRNA片段与目的载体连接，连接产物加入至DH5q感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行PCR鉴定、DNA测序。2、GeneA过表达裁体构建从PubmedNuc1eotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，将序列导入DNAMAN软件中，进行酶切位点分析；在该序列中

3、不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶一ECOR1和SCIC11。弓I物直接在GeneACDS编码区起始和末端设计，然后在引物的坟端加上相应的酶切位点。以CDNA为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理片段并纯化回收。以同样的酶切位点处理PCDH载体以使其线性化，胶回收载体后与片段连接并转化DH5a感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。3、GeneA点突变载体构建版本1：根据突变位点特异性设计突变寡核昔酸引物并合成含突变位点且互补的两条引物。在PrimeSTARGX1DNAPo1ymerCISe聚合酶的作用下，合成整个含有突变位点的质粒。

4、在反应液中加入DPr1I显著性内切酶，371hoDpnI只能切断腺噂吟甲基化的DNA,能将含有甲基化的原始模板消化，留下没有甲基修饰的突变质粒。将反应液转化人感受态大肠杆菌。PCR所得的突变质粒的缺口能在大肠杆菌中得到修复，所获得的菌落即含有突变质粒。版本2:使用HieffMutSite-DirectedMutagenesisKit定点突变试剂盒构建GeneA点突变载体。针对需引入突变的区域设计含突变位点的引物，将质粒进行反向PCR扩增，扩增产物与DPn1混合，置于37。C恒温反应12小时进行消化，去除甲基化模板质粒。配制含有EXnQSe的单点突变重组反应体系。置于37。C反应30min。待反

5、应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。取201冷却反应液，加入到200感受态细胞中进行转化，随后取1001菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，长出来的阳性克隆PCR,测序鉴定。4、GeneA敲除载体构建（CRISPR/Cqs9法）从NCB1数据库中查询GeneA的CDS序列，在外显子中确定待敲除的序列，选择23-250bp的外显子序列输入软件中，进行特异sgRNA设计，根据输出的SgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNAOIigoso将合成的O1igos以逐步降温的方法退货成双链，然后与Cqs9质粒进行连接，转化DH5q感受态大肠杆菌细胞，涂板，阳性克隆测序，正确的阳性克隆，小抽

6、后获得含ShRNA表达元件的Cos9质粒。错配酶法检测剪切活性：靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（CE11或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，判断CQS/sgRNA的活性。二、病毒包装Is慢病毒包装使用C1ontech公司的1enti-XTMHTXpackagingSystem第四代慢病毒包装系统。转染前约24hr,以4-51061enti-X293T细胞/100mm板的密度接种IOmI细胞，培养过夜。按照说明书，将致力DNA转染体系和PoIymer体系分另IJ混匀，再将两者混合后室温孵育IOmin后滴加至293T细胞中，十字

7、形摇晃混匀。4小时候换液，继续培养48小时，收获病毒上清，50Og离心IOmin去除细胞碎片，冻存于-80。C待用。1enti-XG。StiXTM检测病毒滴度或者按照梯度稀释法,转染293T细胞,根据感染效率判断滴度。2、腺病毒/腺相关病毒包装取5g重组质粒用Pac1酶切然后胶回收大片段，用TurboFectTMinVitrotrQnSfeCtiOnRengent以2g每孔（6孔板）转染融合度为8050%的293T细胞包装病毒。转染后24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光数量与分布情况，以跟踪腺病毒的包装与增殖过程；转染6-8d,局部出现绿色荧光葡萄串样聚集现象；转染10-12天，大量细胞病变变圆

8、脱壁，出现明显的空斑，待约50%细胞从培养容器底部脱落时收集全部培养液与细胞至离心管中，将细胞悬液于-80/37。C反复冻融并涡旋振荡2次，5000g离心5min,收集上清液，即为第1代病毒悬液。用第1代病毒悬液侵染融合度约90%的293A细胞，2-3天后，细胞出现病变，开始变圆脱落,待脱落50%左右,收集细胞按前述方法收集上清液,即为第2代病毒悬液。用第2代病毒悬液再次侵染293T细胞，重复“侵染一冻融一收集”，以大量扩繁病毒和提高病毒滴度。将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定病毒滴度。三、细胞功能检测试验细胞预处理（以用敲减基因研究基因对细胞增殖为例）：细胞以50000

9、个/孔接种于6孔板，实验分组：空白对照阴性对照实验组。37,5%（2。2培养过夜后，换上OPT1-MEM培养基，同时加入根据MO1计算所需的病毒量，轻轻摇匀后继续培养4天，期间在荧光显微镜下观察绿荧光表达效率。1、细胞活性检测DMTT实验消化细胞并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度于96孔板中接种，每组设置5个复孔,连续检测5天。检测前,每孔加入2015mgm1的M（PBS配制，pH=7.4）,与37中孵育4h,小心吸去上清液后，每孔加入1501DMSO,震荡IOmin,使结晶物充分溶解。然后在酶标仪上，读取49Onm波长的吸光值。2） CCK8实验使用Ce11CoUntingKit（C

10、CK8）CCK-8/WST-8试剂盒：消化细胞并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度于96孔板中接种，每组设置5个复孔，连续检测5天。检测前，每孔加入101CCK-8试剂，37C避光孵育2h;然后将孵育后的培养基移到酶标板中，450nm处用BIO-RAD酶标仪测定的吸光度。3） BrdU实验细胞以1.5x105个m细胞量接种于六孔板中（内放置一盖玻片），每组设置3个复孔，培养1天，用含04%FBS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于Go期。加入BrdU（储液：1.0mgm1,终浓度为0.03gm1）,37,孵育40min.吸去上清，盖玻片用PBS轻轻洗涤2-3次，置于甲醇中固定IOmin后

11、在空气中干燥，0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。随后用5%正常兔血清封闭，甲酰胺Ioo七,5min变性核酸，冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1:50）,阴性对照加PBS或血清。按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数。2、克隆形成1）平板克隆（贴壁细胞）细胞以500个/孔的细胞量接种于六孔板中，十字形手法摇匀，每组设置3个复孔，37,5%CC中培养。每隔2天在显微镜下观察克隆的大小，每隔3天换上新的培养液。待大多数单克隆中的细胞数大于50的时候，在荧光显微镜下拍照。随后吸去培养液

12、，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1m110%甲醇溶液固定细胞30秒钟。吸去甲醇溶液，每孔加0.1m1结晶紫染液，室温中放置20分钟。轻轻甩去染色液，用蒸僧水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37。C烘干。2）软琼脂集落形成（悬浮细胞）细胞消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1000个/m1。制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和37左右预温的细胞悬液以1:9比例在40均匀混合，加入培养皿（直径60mm）中，每皿含0.5%琼脂培养基2m1,室温下琼脂完全凝固。制备上层琼脂,取37不同密度梯度（按照每皿含50、100、200个）的细胞悬液1.5m1移入小烧杯中，加入40、5%琼脂等

13、体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。37、5%CC）2静置培养2-3周后观察克隆形成情况。3、细胞周期细胞以30%的密度接种于6cm培养皿中，48h后用胰酶消化细胞，收集样品；12,000rpm离心5min,收集细胞，弃上清；用预冷的PBS洗涤两次，加入预冷的70%乙醇，于-20固定过夜；1,50OrPm离心5min,弃上清，用3m1的PBS洗涤一次；加入2501的100gm1碘化丙嚏(propidimiodide,P1),2501RNaseA(100gm1),4避光孵育30min;上流式细胞仪前以200目尼龙网膜过滤

14、细胞，以防细胞团聚堵塞流式细胞仪；采用Beckman流式细胞仪分析样品，计数2-3万个细胞；流式细胞仪结果用细胞周期拟和软件F1owjo进行分析，每组实验独立三次重复。4、细胞凋亡1) AnexinV7-AAD流式使用凯基公司KGA1026试剂盒。用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm,3min离心，吸去上清，用PBS洗1遍，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。取1E+5个细胞量的悬液，离心弃上清，加入5001Bindingbuffer重悬细胞。加入51AnnexinV-APC5混匀后，再加入517-AAD染液，混匀，室温，避光，反应5-15min后置于冰上。1小时内进行流

15、式细胞仪机检测。GFP的绿色荧光：FITC通道筛选GFP阳性细胞进行AnnexinV-APC/7-AAD荧光检测。AnnexinV-APC的红色荧光:激发波长633nm,最大发射波长660nmo7-AAD红色荧光:激发波长Ex=546nm;发射波长Em=647nm。2) DAP1染色培养的单层细胞(未固定)或新鲜组织的冰冻切片等，PBS漂洗5分钟；DAP1工作液(DAP1储存液：将0.50口臼溶于501加85中，分装，低温长期保存；DAP1工作液：用PBS稀释DAPI储存液，终浓度为0.1ugm1)室温染色520分钟(可根据实验材料的染色结果而定)；PBS漂洗；水溶性封片剂封片，游离细胞也可直

16、接用含DAP1的PBS封片；最后进行荧光显微镜观察：正常的细胞核呈强荧光，细胞质无荧光；固定的组织细胞同样处理，亦可得到相似的染色结果。5、细胞运动1)细胞划痕实验消化细胞，按照80%的密度，接种于24孔板，每组设置三组重复。细胞培养过夜后，用预先灭菌的细竹签或枪头在孔的中部横向划伤一个区域，确保每一组划伤的区域大小一致，用PBS洗去漂浮的细胞，加入新鲜培养基。每隔24h进行一次显微拍照，第一次拍照时作好记录,以后每次观察和拍照记录同一区域细胞生长的状态。照片用IPP统计软件对愈合前后的划伤区域面积进行统计，比较不同组之间愈合的速度，以此判断细胞的运动能力。2) TrQnSWe11小室(Corning,3422)迁移实验/motrige1预制TrQnSWeII小室(BD,354480)侵袭实验实验