国家自然基金申请书写作：核酸检测篇-2-二代DNA测序技术.docx

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1、编号：2-2主题：第二代DNA测序技术概述：第一代测序(缺点：通量低IOOO个核苦酸/反应，费用高) 化学降解法 双脱氧链终止法(Sanger法) 荧光自动测序技术 杂交测序技术高通量测序：第二代测序(next-generationsequencing,NGS)第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(SeqU6ncingbySynthesis),即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454F1X、I11uminaZSoIexaGenomeAna1yzer和App1iedBiosystemsSO1IDsystemo这三个技术平台各有优点，454F1X的

2、测序片段比较长，高质量的读长(read)能达到400bp;So1exa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10;SO1ID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%,是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以I1IUminQ/So1exoGenomeAna1yzer测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。原理：I11uminaZSo

3、IexaGenomeAnci1yzer测序的基本原理是边合成边测序。在SQnger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。I11uminaSo1exa测序仪特点:桥式PCR,边合成边测序可逆终止物I11uminaSo1exa测序流程：操作步骤：1)测序文库的构建(1ibrQyConstruction)首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200g,但是GnomeAna1yzer系统所需的样品量可低至IOOn

4、g,能应用在很多样品有限的实验中),然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头(AdQPtor)。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成CDNA,然后加上接头，或者先将RNA反转成CDNA,然后再片段化并加上接头。片段的大小(InSertSiZe)对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insertsize,以便在组装(ASSemb1y)的时候获得更多的信息。2)锚定桥接(SUrfQCeA甘QChmentandBridgeAmp1ification)So1exa测序的反应在叫做f1owce11

5、的玻璃管中进行，f1owce11又被细分成8个1one,每个1Qne的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3)预扩增(DenQturQtiOnandComp1eteAmp1ification)添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在F1e)WCeI1的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4)单碱基延伸测序(SingIeBaseExtensionandSequ

6、encing)在测序的f1owCe11中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做BaseCa11ing,I11umina公司BaseCa11ing所用的软件是I11uminasGenomeAna1yzerSequencingContro1SoftwareandPipe1ineAna1ysisSoftwareo读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5)数据分析(DQtC1Ana1yzing)这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步，前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。